Lo studio delle cellule tumorali circolanti: dalla sfida ... - Enea

Poste Italiane S.p.A. - Sped. in Abb. Postale - D.L. 353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 n. 46) art. 1 com. 1 - DCB - Roma 

Vol. 20, Num. 2 

P e r i o d i c o d e l l a S o c i e t à I t a l i a n a d i C i t o m e t r i a 

Lo studio delle cellule tumorali circolanti: dalla sfida 

tecnologica alle possibili ricadute cliniche 

Caratterizzazione citometrica delle lamine nucleari 

in cellule di neuroblastoma umano 

Autofagia e stress ossidativo nella malattia di 

Niemann-Pick: valutazione..... mediante citometria a flusso 

Applicazione della Citometria a flusso nella diagnosi 

delle sindromi mielodisplastiche 

Agosto 2011

Vol. 20, Num. 2 

DIRETTORE RESPONSABILE 

Raffaele De Vita 

COMITATO EDITORIALE 

Marco Danova 

Dipartimento di Medicina Interna 

Sezione di Medicina Interna 

ed Oncologia Medica 

Università e I.R.C.C.S. - Policlinico S. Matteo 

Pavia 

Raffaele De Vita 

Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell’Uomo 

ENEA - Centro Ricerche Casaccia 

Roma 

Eugenio Erba 

Istituto Ricerche Farmacologiche “Mario Negri” 

Milano 

Giuseppe Starace 

Istituto Medicina Sperimentale CNR 

Roma 

Volume 20, numero 2 Agosto 2011 

Lettere GIC 

Periodico della Società Italiana di Citometria 

Autorizz. del trib. di Roma n° 512/92 del 17/9/92 

Edizione quadrimestrale 

Spedizione in abbonamento postale 

Grafica: Renato Cafieri 

Stampa e Pubblicità: 

Redazione: 

Società 

Italiana di 

Citometria 

c/o Unità Biologia delle Radiazioni e 

Salute dell’Uomo 

ENEA Centro Ricerche Casaccia, s.p. 016 

Via Anguillarese, 301 - 00123 ROMA 

06/30484671 Fax 06/30484891 

e-mail: devita@enea.it 

http://biotec.casaccia.enea.it/GIC/ 

Associato alla 

Unione Stampa 

Periodica Italiana 

Periodico della Società Italiana di Citometria 

SOMMARIO 

In copertina: dal lavoro “Autofagia e stress ossidativo nella 

malattia di Niemann-Pick: valutazione dell’induzione di autofagia 

nella risposta di linfociti b asmasi-/- allo stress ossidativo 

mediante citometria a flusso” E. Cesarini, B. Canonico, M. 

Arcangeletti, L. Galli, S. Papa, F. Palma and F. Luchetti. Le 

immagini di microscopia a fluorescenza mostrano l’uptake del 

marcatore vescicolare arancio di acridina (AO) in cellule di 

controllo, irradiate UVB per 10’, trattate con l’inibitore autofagico 

nocodazolo (NZ) e con nocodazolo + UVB (NZ+UV10’). 

Agosto 2011 

Lo studio delle cellule tumorali circolanti: dalla 

sfida tecnologica alle possibili ricadute cliniche 7 

M. Torchio, G. Mazzini, M. Danova 


in cellule di neuroblastoma umano 13 

G. Maresca e I. D’Agnano 

Autofagia e stress ossidativo nella malattia di 

Niemann-Pick: valutazione..... mediante citometria 

a flusso 23 

E. Cesarini, B. Canonico, M. Arcangeletti, L. Galli, S. Papa, F. Palma 

and F. Luchetti 

Applicazione della Citometria a flusso nella 

diagnosi delle sindromi mielodisplastiche 29 

C. Picone, F. Lanza, L. Del Vecchio, M.G. Della Porta 

Viaggiando per convegni 37 

a cura del “Viaggiatore” 

Lettere GIC Vol. 19, Num. 2 - Agosto 2010 SOMMARIO 5

Lo studio delle cellule tumorali circolanti: dalla sfida 

tecnologica alle possibili ricadute cliniche 

M. Torchio 1, G. Mazzini 2, M. Danova 1 

1Unità Operativa di Medicina Interna ed Oncologia Medica, Ospedale Civile di Vigevano, 

Azienda Ospedaliera di Pavia. 

2Istituto di Genetica Molecolare C.N.R. Sez. Istochimica & Citometria; 

Dipartimento di Biologia Animale, Università degli Studi di Pavia. 

Introduzione 

Negli anni recenti, numerosi studi in ambito oncologico 

si sono concentrati sull’identificazione di quelli che vengono 

oggi definiti “biomarcatori”, intesi come distinti 

indicatori biologici capaci di verificare la presenza o 

l’estensione di un tumore (prima, durante e dopo una 

terapia) di valutarne l’aggressività biologica e di stimare 

la probabilità di risposta del tumore a determinati tipi di 

trattamento (1). Alcuni di questi studi si sono inizialmente 

rivelati molto promettenti ma va considerato che successive 

sperimentazioni hanno spesso dimostrato come i 

risultati non fossero in linea con le osservazioni iniziali e 

conducessero a conclusioni inconsistenti sul piano di una 

reale applicabilità in clinica. 

In questo ambito di studi, svariati Autori si sono focalizzati 

sull’analisi delle cellule tumorali disseminate nel 

midollo osseo e sulle cellule tumorali circolanti (CTCs) 

nel sangue periferico di pazienti con neoplasie maligne 

di origine epiteliale (2). La maggior facilità di prelievo di 

un campione di sangue rispetto ad uno di midollo osseo, 

ha ovviamente dato un forte impulso alla diffusione degli 

studi basati su questo materiale, con l’obiettivo di identificarne 

un potenziale ruolo di indicatore prognostico e 

terapeutico. 

Queste cellule sono presenti nella circolazione sanguigna 

di molti pazienti affetti da differenti tipi di tumore solido, 

il loro numero è estremamente basso e sono costituite 

da una popolazione nel complesso molto eterogenea 

con caratteristiche biologiche e molecolari spesso diverse 

rispetto a quelle della lesione neoplastica primitiva. La 

determinazione delle CTCs potrebbe da una parte fornire 

informazioni utili per selezionare pazienti candidati a 

specifici trattamenti a finalità adiuvante o della fase 

avanzata di malattia e monitorarne la risposta, dall’altra 

fornire una caratterizzazione molecolare del potenziale 

metastatico delle cellule tumorali, contribuendo in tal 

modo anche ad identificare nuovi potenziali bersagli 

terapeutici. 

Lettere GIC Vol. 19, Num. 2 - Agosto 2010 

e-mail: onco.vigevano@gmail.com 

Storicamente, le CTCs sono sempre state considerate 

molto difficili da isolare e sono stati ottenuti risultati 

discordanti con le diverse metodologie d’identificazione di 

volta in volta impiegate. Anche se negli anni recenti sono 

stati messi a punto svariati metodi sia di tipo immunocitochimico 

che di tipo molecolare, isolare e quantificare in 

modo standardizzato, così come caratterizzare sul piano 

molecolare le CTCs rappresenta ancora tutt’oggi una vera 

e propria sfida sul piano tecnico-metodologico (3). 

Essendo definiti come “eventi rari”, tali cellule devono 

inizialmente essere sottoposte a processi di arricchimento 

e di separazione pre-analitica che lasciano successivamente 

spazio alla possibilità di eseguire ulteriori caratterizzazioni 

molecolari. 

Tecniche di arricchimento 

Le tecniche di arricchimento hanno l’obiettivo di separare 

le CTCs dalle restanti cellule ematiche sfruttando le 

caratteristiche fisiche delle cellule (4): a) la diversità di 

densità, utilizzando kit a densità di gradiente liquido 

(come le metodiche Ficoll, Lymphoprep, OncoQuick ® ) 

(5,6) e b) le differenti dimensioni cellulari, impiegando 

dei filtri- membrane porose attraverso le quali viene 

fatto passare il campione ematico ad una velocità costante 

con flusso laminare (7). Due evoluzioni di quest’ultimo 

dispositivo sono rappresentate da una microfiltrazione 

tridimensionale (8,9). Un metodo più recente si basa 

sull’arricchimento immunomagnetico, che sfrutta 

l’espressione di specifici markers sulla superficie cellulare 

(10). Il suo primo limite è la difficoltà di individuare 

antigeni espressi anche sulle membrane cellulari delle 

altre popolazioni presenti nel sangue umano. 

Generalmente vengono impiegati anticorpi diretti contro 

citocheratine, EPCAM e BerEP4: l’espressione aspecifica 

di alcuni antigeni, quali le citocheratine 8 (CK8), 18 e 

19 in cellule normali di origine epiteliale può condurre a 

falsi-positivi. La ricerca di antigeni maggiormente specifici 

ha portato a testare marcatori organo-relati come 

ATTIVITÀ SCIENTIFICA 

7

8 

l‘Antigene Prostatico Specifico (PSA), l’Antigene 

Carcinoembrionario (CEA), ed il recettore per il fattore 

di crescita epidermoidale 2 (EGFR2/HER2). 

L’arricchimento basato su metodiche immunomagnetiche 

può a sua volta essere integrato con metodiche 

quali la RT-PCR, la FISH, la citometria a flusso (CF) o 

la image-cytometry. 

Tecniche di analisi 

CellSearch®- CellSearch® è un sistema automatizzato 

di arricchimento ed analisi immunocitochimica delle 

CTCs (11). Sviluppato da Immunicon Corporation e 

Veridex, è l’unico che ad oggi ha ottenuto l’approvazione 

della U.S.” Food and Drug Administration” per la ricerca 

di CTCs nelle neoplasie mammaria, prostatica e colorettale 

in fase avanzata (12). Questa tecnologia si basa 

sulla combinazione della metodica immunomagnetica e 

della microscopia digitale automatizzata. Il processo 

d’identificazione delle CTCs sfrutta il loro riconoscimento 

tramite il legame con un anticorpo diretto contro 

una molecola di adesione della cellula epiteliale, 

EPCAM, frequentemente sovraespressa nei carcinomi 

mammario, prostatico, colo-rettale, testa-collo ma assente 

nelle cellule del sangue. Gli anticorpi diretti contro 

EPCAM sono coniugati con ferrofluid ed una volta che 

le CTCs si legano a questi anticorpi, un potente magnete 

le “estrae” dal sangue. Per completare la selezione, le 

cellule devono essere positive per l’espressione delle 

CK, positive per il 4’,6-diamidino-2-fenindolo, DAPI e 

negative per l’espressione di CD45.Le CTCs devono 

anche possedere caratteristiche di malignità citologica 

ovvero grandi dimensioni, nuclei ipercromatici ed evidenti, 

nucleoli prominenti (11,13). 

Il limite principale della strategia utilizzata è rappresentato 

dalla fase di arricchimento basata sull’anticorpo 

anti-EPCAM. Diversi Autori hanno evidenziato 

un’espressione eterogenea di EPCAM nel carcinoma 

mammario ed una alterata regolazione a livello molecolare 

di EPCAM è stata suggerita quale possibile causa di 

disseminazione delle cellule tumorali nel midollo osseo 

e nel sangue periferico. A questo proposito è stato ipotizzato 

che una sotto-valutazione nella rilevazione delle 

CTCs, utilizzando i sistemi basati su EPCAM, sia correlata 

con una minor espressione di questa molecola di 

adesione nel carcinoma mammario “normal-like”, sottotipo 

tumorale identificato attraverso il profilo 

d’espressione genica con caratteristiche di particolare 

aggressività (14). 

Recentemente, è stato riportato come l’aggiunta di 

CD146 (un marcatore specifico per le cellule carcinomatose 

mammarie prive dell’espressione di EPCAM e che 

può essere evidenziato con anticorpo anti-CD146 coniugato 

a ferrofluid) possa fungere da marcatore nella rilevazione 

delle CTCs EPCAM negative, con la medesima 

rilevanza clinica delle sole CTCs EPCAM positive nel 

selezionare pazienti con cattiva prognosi (15). Sono in 

corso anche studi volti a testare nuovi marcatori genici 

per le CTCs (16). 

Citometria a Flusso- E’ una tecnica analitica importante 

in quanto è in grado di analizzare migliaia di cellule in 

un campione di volume ridotto, in un tempo rapido e con 

la possibilità di valutare contemporaneamente differenti 

parametri cellulari. Nata inizialmente per lo studio del 

DNA, ha successivamente trovato applicazione nello 

studio del ciclo cellulare: negli ultimi anni è stata impiegata 

nell’analisi e nella conta dei cosiddetti “eventi rari”. 

Uno dei maggiori punti di forza della CF rimane la sua 

capacità di raccogliere più informazioni dalla stessa cellula 

all’interno di un campione eterogeneo. Questa tecnologia 

analitica non è stata sviluppata per contare le cellule 

ma per analizzare la loro distribuzione in riferimento 

a vari parametri supportati sia da variabili fisiche che 

dall’emissione di fluorescenza indotta dalla presenza di 

legami specifici (17). Inoltre, è importante ricordare che 

la CF generalmente non fornisce un valore assoluto degli 

eventi analizzati ma una stima, un valore relativo, dovuto 

anche al fatto che il campione iniziale viene notevolmente 

diluito dal “liquido di trascinamento” durante 

l’analisi. 

La principale limitazione della CF è la perdita del campione 

al termine dell’analisi stessa. Le cellule vengono 

infatti eliminate insieme al liquido di trascinamento e 

quindi non possono essere utilizzate per test successivi. I 

dati vengono registrati in un database e rappresentati 

sotto forma di istogrammi e grafici. In pratica, nel caso 

di un numero veramente ridotto di cellule analizzate, 

esse appaiono come clusters di pochi punti sul grafico, la 

cui identificazione non può essere confermata. Questo 

limite può essere in parte superato combinando la CF 

convenzionale con le tecniche d’immagine: un esempio 

di tale combinazione è rappresentato dalla metodica 

ImageStream® (18). Nonostante alcuni limiti , la CF 

rimane una metodica importante nell’analisi e nella 

conta delle CTCs, anche se ad oggi non del tutto standardizzata 

(19-23). Un’evoluzione della CF è una strumentazione 

caratterizzata dallo stesso principio di funzionamento 

ma realizzato in “scala miniaturizzata” ovvero 

all’interno di un “microchip di silicio” dedicato o alla 

“gestione” di piccoli volumi di campione ( a valle di un 

procedimento di pre-arricchimento) (24). 

Metodiche “image-based” - La morfologia gioca un 

ruolo unico nella classificazione e nell’analisi delle cellule, 

ruolo peraltro confermato sia in campo biologico 

che in campo clinico a partire dallo scorso secolo. 

L’avvento dei marcatori fluorescenti ha fornito un importante 

contributo alla microscopia incrementandone la 

sensibilità, e la capacità di rilevare l’espressione di marcatori 

biologici che consentano di differenziare la cellula 

normale da quella maligna. Nel tempo, i miglioramenti 

tecnologici ottenuti nel campo delle sorgenti di luce 

ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011

(laser, power LEDs) e la sempre maggiore automazione 

hanno indiscutibilmente reso la microscopia a fluorescenza 

uno strumento fondamentale in specifiche aree 

della biomedicina, dove morfologia e sensibilità giocano 

un ruolo cruciale (25). Con l’avvento della CF alcune 

problematiche ed alcuni limiti della microscopia nell’analisi 

di routine sono stati superati (per esempio nell’immunofenotipo) 

ma dall’altro lato, è nata una sorta di 

competizione tra le due metodiche e parallelamente sono 

stati fatti degli sforzi nel tentativo di combinare i due 

strumenti proprio per analizzare gli “eventi rari” (18). 

Svariate tecnologie basate sull’immunofluorescenza 

sono state recentemente impiegate per migliorare la 

soglia di rilevazione, sfruttando l’introduzione di dispositivi 

di scansione automatizzati, come la scansione a 

fibre ottiche ed il citometro a scansione laser (MAIN- 

TRAC®) (26). Questo tipo di approccio combinato ha 

consentito di raggiungere una misurazione ed una visualizzazione 

più precise, con una maggiore flessibilità che 

facilita la conta delle CTCs, riducendo la variabilità 

intra-operatore. 

Approcci analitici basati sulla biologia molecolare - 

Vengono considerate analisi molecolari tutte le tecnologie 

basate sulla RT-PCR: esse si sono dimostrate preziose nel 

rendere possibile una distinzione delle cellule sulla base 

del loro differente profilo d’espressione genica. Poiché il 

DNA “libero” nel torrente ematico può generare dei risultati 

falsamente positivi, si preferisce come bersaglio della 

metodica PCR l’mRNA (27,28): questo gruppo di metodiche 

sfrutta l’espressione di alcuni geni tumore-relati o di 

alcuni antigeni epiteliali presenti sulle CTCs (29-31). 

Rispetto alle tecniche basate sul profilo proteico, la RT- 

PCR è più sensibile nel rilevare marcatori molecolari 

tumore-specifici, ed offre una più alta specificità (32). I 

limiti di questo tipo di approccio metodologico sono la 

problematica connessa alla scelta del marcatore, la possibilità 

di ottenere falsi positivi a causa della contaminazione 

da parte di acidi nucleici non tumore-specifici (33) e la 

necessità di lisare le cellule, che preclude ogni possibile 

eventuale analisi successiva sulle CTCs (EPISPOT, 

AdnaTest®, Telomescan®) (34-36). 

Microchips - Ricerche recenti hanno sviluppato numerosi 

e differenti esempi di dispositivi “microfluidici” 

direttamente realizzati in “chip” di silicio finalizzati ad 

una accurata gestione di sospensioni cellulari quali il 

sangue periferico intero, Nagrath e Colleghi hanno brevettato 

il “CTC-chip”, ovvero un dispositivo microfluidico 

che consente di processare direttamente il sangue 

intero: il campione ematico viene fatto scorrere in condizioni 

di flusso laminare controllato attraverso una griglia 

di micropunte, le cui pareti sono rivestite di anticorpi 

anti-EPCAM (37). Lo stesso gruppo ha recentemente 

presentato una evoluzione di tale dispositivo, 

“l’Herringbone-chip (HB-Chip)”, rappresentato sempre 


da un microchip con un nuovo disegno (definito a “lisca 

di pesce”), che, rispetto al precedente, è in grado di 

generare dei microvortici che aumentano il numero 

d’interazioni tra le cellule e la superficie del dispositivo 

stesso al quale si trovano adesi gli anticorpi specifici 

(38). Vi sono infine tecnologie emergenti come il 

DEPArray®, basato sempre su microchip di silicio in 

grado di separare sottopopolazioni cellulari sfruttando le 

cariche elettriche superficiali. Questa metodica è molto 

sensibile, ma deve tuttavia essere ancora validata sul 

piano clinico mediante l‘esecuzione di trials clinici 

opportunamente disegnati in campo oncologico. 

Micro-Count® - Recentemente, il nostro gruppo ha sviluppato 

un approccio semplice ed innovativo per 

l’arricchimento immunomagnetico delle CTCs dal sangue 

periferico, e la loro cattura finale al centro di un 

vetrino, adatto all’analisi microscopica convenzionale 

(39). Questo dispositivo, denominato Micro-Count®, 

associa alla tecnica immunomagnetica i vantaggi della 

microscopia. Poche centinaia di cellule separate e concentrate 

in una piccola area del vetrino offrono varie possibilità 

di analisi: a) possono essere contate direttamente, 

in contrasto di fase per la prima quantificazione, b) la 

loro vitalità è rapidamente saggiata in campo chiaro (via 

Trypan Blue) o in fluorescenza (via Ioduro di Propidio, 

c) possono essere trasferite in una provetta per successivi 

studi di biologia molecolare, d) possono essere sottoposte 

ad analisi morfologiche d’espressione mediante 

marcatori immunofluorescenti specifici ed un’osservazione 

ad alto ingrandimento (100X). Il dispositivo è 

costituito da una piastra alloggiante potenti magneti al 

neodimio intercambiabili, che si interfacciano con i 

“fondi” dei pozzetti della piastra multi-pozzetto standard 

(da sei pozzetti) con cui il dispositivo funziona. Si può 

lavorare con pozzetti normali per catturare e lavare le 

cellule arricchite al fondo dei pozzetti, per poi recuperarle 

con una pipetta e trasferirle altrove, ad esempio per 

analisi di biologia molecolare. In alternativa, o meglio in 

parallelo, si possono usare pozzetti con vetrino copri 

oggetto quadrato posto al fondo per ottenere le cellule 

direttamente pronte per l’analisi al microscopio di cui si 

è detto più sopra. In questo modo le cellule sono trattate 

in modo meno invasivo rispetto ai sistemi “in colonna” 

con il risultato di un danno minore alla loro vitalità. 

“Lab-on-chip” - L’esperienza acquisita nelle ricerche di 

“micro-fluidica” è oggi ulteriormente implementata nei 

dispositivi cosiddetti “lab-on-chips”. In linea di massima, 

queste nuove tecniche si confrontano con la necessità di 

minimizzare il danno indotto alle CTCs durante la preparazione, 

l’analisi e la separazione, con la capacità di ridurre 

l’interferenza con tutte le altre popolazioni cellulari presenti 

nel campione e nel contempo di massimizzare il “segnale” 

ottenuto dalle cellule bersaglio. Anche con approcci tecnologici 

differenti questi “dispositivi” hanno in comune il 


9

10 

“tentativo” di rilevare le cellule d’interesse procurando loro 

il minor grado di stress e rendendole disponibili per 

l’esecuzione di analisi successive (40). 

Applicazioni cliniche in oncologia 

Tumori in stadio iniziale – L’estrema eterogeneità 

tumorale fa sì che nell’ambito della lesione in stadio precoce, 

la decisione clinica sia frutto di un algoritmo diagnostico 

ad oggi basato sull’impiego di indicatori prognostici 

codificati e considerati “convenzionali” (come 

le dimensioni tumorali, il grado di differenziazione e lo 

status di HER2). Questi parametri forniscono informazioni 

aggiuntive al clinico ma non sono del tutto in grado 

di consentire un’accurata predizione dell’outcome, ovvero 

la prognosi, del paziente. 

Questa incertezza nel predire il decorso della malattia si 

può tradurre in un sotto- o sovra-trattamento: alcuni 

pazienti, che necessiterebbero di una terapia sistemica 

per curare la malattia metastatica non rilevabile, non 

ricevono il trattamento, mentre altri, che sono stati curati 

con successo attraverso un approccio locale (chirurgico 

e radioterapico), e non richiedono una terapia sistemica, 

vengono esposti inutilmente ad effetti tossici collaterali. 

Inoltre, si manifesta il bisogno di sviluppare strumenti 

che possano rivelarsi utili nel predire accuratamente 

ed in modo personalizzato la prognosi. 

Alcuni studi hanno dimostrato come le CTCs possono 

essere osservate nel 20-54% dei pazienti con neoplasia 

mammaria in stadio precoce utilizzando la metodologia 

PCR basata su saggi per CK19 e nel 10% attraverso il 

sistema CellSearch®. In alcuni casi questo può essere 

correlato con un peggior outcome sia in termini di 

sopravvivenza libera da progressione (progression free 

survival PFS) che di sopravvivenza globale (overall survival 

OS), indipendentemente dallo stato linfonodale e 

dalla terapia adiuvante. Ugualmente, in pazienti affetti 

da carcinoma colo-rettale in stadio precoce sottoposti a 

resezione chirurgica curativa, le CTCs identificate dalla 

positività dell’mRNA sia per CK20 che per CEA, testate 

entro 24 ore dal prelievo, sono risultate indicative per 

recidiva. Al contrario, studi sulla neoplasia prostatica 

localizzata non hanno mostrato questa correlazione: le 

analisi delle CTCs, sia attraverso il sistema CellSearch®, 

che attraverso la RT-PCR su vari tipi di trascritti, hanno 

dimostrato che le cellule erano raramente osservabili in 

pazienti con malattia localizzata. 

Ad oggi, l’evidenza riguardante la questione su come la 

rilevazione e la quantificazione delle CTCs possano 

essere utili nell’influenzare la decisione clinica nella fase 

precoce della malattia e/o in ambito adiuvante non è stata 

definita completamente. Anzi, a fronte del maggior 

numero di dati disponibili sulla neoplasia mammaria le 

linee guida dell’American Society of Clinical Oncology, 

a proposito del pannello dei marcatori tumorali, hanno 

affermato che i risultati della valutazione corrente delle 

CTCs nell’ambito della neoplasia mammaria in fase pre- 

coce devono essere considerati ad un livello di evidenza 

III°, e perciò non ancora sufficiente per un’applicazione 

nella pratica clinica corrente (41). 

Tumori in stadio avanzato - L’obiettivo clinico del trattamento 

di neoplasie in fase metastatica è scegliere un 

regime terapeutico che sia associato al più elevato tasso di 

risposte ed al maggior effetto palliativo, a fronte del più 

basso rischio di tossicità possibile. Questa terapia viene 

solitamente proseguita fino a quando si registra una tossicità 

importante o si evidenza una progressione di malattia. 

Inoltre, in questo ambito, sarebbero particolarmente utili 

nuovi parametri clinici capaci d’indicare accuratamente 

una progressione di malattia e/o di predire una risposta 

alla terapia. Attualmente, il monitoraggio di pazienti con 

malattia in fase metastatica rappresenta la principale applicazione 

pratica dell’analisi delle CTCs. 

In differenti studi, condotti servendosi delle più varie 

metodiche d’isolamento delle CTCs, è stato osservato 

come queste ultime siano rilevabili in una popolazione di 

pazienti affetti da neoplasia mammaria avanzata, in un 

intervallo compreso tra il 26% ed il 49% del totale dei soggetti 

portatori della patologia. La maggior parte delle evidenze 

che supportano l’impiego in clinica delle CTCs in 

pazienti con malattia metastatica derivano dall’utilizzo del 

sistema CellSearch® (12) e , i dati disponibili sino ad oggi 

sostengono il ruolo della CTC quale marcatore prognostico 

in pazienti con neoplasia mammaria metastatica. 

Una prima indicazione del potenziale prognostico delle 

CTCs è stata descritta da Massimo Cristofanilli e 

Colleghi in un report del 2004, pubblicato sul New 

England Journal of Medicine (11), che osservava come il 

60-70% dei pazienti con neoplasia mammaria metastatica 

avesse una conta di CTCs >=2 cellule per 7,5 mL, 

mentre nei soggetti di controllo sani le CTCs venivano 

raramente osservate. E’ stato inoltre dimostrato che 

pazienti con conta di CTCs maggiore o uguale al basale 

avevano una sopravvivenza libera da progressione PFS 

ed una OS peggiori rispetto a pazienti con conte di CTCs 

minori. Studi successivi dimostrarono risultati sovrapponibili 

per i carcinomi prostatico e colo-rettale in fase 

avanzata, con un numero soglia di CTCs al basale di 

valore >=5 CTCs nel caso di carcinoma prostatico e >=3 

CTCs nel carcinoma colo-rettale. 

In alcuni casi, l’analisi delle CTCs si è rivelata essere più 

affidabile nel predire la risposta al trattamento rispetto 

alle metodiche comunemente impiegate, come i rilievi 

radiologici nella neoplasia mammaria od il dosaggio del 

PSA nel carcinoma prostatico. 

La conta delle CTCs potrebbe rivelarsi utile anche per 

monitorare in modo seriato la risposta al trattamento. In 

pazienti affetti da carcinoma mammario, prostatico e 

colo-rettale avanzato con malattia non misurabile, un 

decremento dei livelli di CTCs registrato da 2 a 5 settimane 

dopo l’inizio della terapia sistemica, si correlava 

con una PFS ed una OS migliori. Inoltre, non vi sono dati 

ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011

disponibili per capire se variando il trattamento, sulla 

base di un cambiamento nel valore della conta delle 

"CTCs, outcome migliori“. Questo interrogativo viene 

indagato in uno studio in corso promosso dal National 

Cancer Institute (NCI) e condotto dal Southwest 

Oncology Group (SWOG 0500, numero di registrazione 

NCI 00382018). Questa sperimentazione clinica arruolerà 

500 donne con carcinoma mammario in fase metastatica 

che verranno sottoposte ad una valutazione basale 

delle CTCs e dopo il primo ciclo di trattamento chemioterapico 

di prima linea. Tutte le pazienti che mostreranno 

una conta persistentemente elevata di CTCs dopo 

l’inizio della terapia saranno randomizzate a continuare 

il trattamento iniziale fino ad evidenza clinica-radiologica 

di progressione di malattia, o a passare ad un altro 

agente chemioterapico. Questo trial dovrebbe fornire 

informazioni circa l’ipotesi secondo la quale a fronte di 

un aumento delle CTCs sia più efficace cambiare il regime 

terapeutico o aspettare fino alla progressione clinica 

manifesta di malattia. 

In maniera simile a quanto è accaduto per l’ambito della 

fase precoce, le correnti linee guida non inseriscono 

ancora l’utilizzo dei saggi per le CTCs negli algoritmi di 

pratica clinica né per la neoplasia mammaria avanzata né 

per le altre neoplasie solide maligne (41). 

Conclusioni e prospettive future 

La separazione e la conta delle CTCs nel sangue periferico 

di pazienti portatori di patologia neoplastica ha suscitato 

un grande interesse nel recente passato, portando con 

sé possibili importanti ricadute biologiche e cliniche. 

Da un punto di vista tecnico-metodologico, un progresso 

significativo è stato raggiunto nella quantificazione e 

nell’isolamento delle CTCs ma è necessario un’ulteriore 

sforzo per definire chiaramente la sensibilità delle varie 

metodiche e la maniera ottimale per integrarle nella pratica 

clinica (42,43). 

Il successo della rilevazione di un evento raro con le 

varie metodiche automatizzate di citometria è innanzitutto 

influenzato da parametri che includono la qualità del 

campione iniziale, la specificità ed il livello 

d’espressione dei marcatori scelti, la robustezza del saggio, 

la valutazione dell’oggettività, la riproducibilità del 

risultato e la variabilità intra- ed inter-laboratorio. 

Il ruolo critico di uno specifico numero di CTCs in un 

determinato volume di sangue, utilizzato per definire 

pazienti con buona e cattiva prognosi, sembra essere più 

che altro un numero arbitrario con significatività statistica 

tra due gruppi, piuttosto che un numero di attuale rilevanza 

biologica e clinica. Da un punto di vista biologico 

si può ipotizzare che più è grande il numero di CTCs presente 

nel sangue di un paziente, più aggressiva sarà la 

malattia e peggiore sarà la prognosi, questo però non è 

stato ad oggi dimostrato, e perciò sarebbe opportuno 

adottare alcune precauzioni quando si utilizza un numero 

come soglia cut-off per stratificare i pazienti affetti da 


carcinoma in sottogruppi con differente prognosi al fine 

di effettuare una scelta clinica. 

Un altro interrogativo è se i vari approcci analitici identifichino 

le stesse cellule. Il numero di cellule identificabile 

e la percentuale di pazienti nei quali le cellule possono 

essere rivelate è ampiamente differente tra studio e studio. 

Differenti piattaforme di analisi potrebbero infatti identificare 

diverse sottopopolazioni di cellule circolanti. 

Mancano dati clinici provenienti da ampie sperimentazioni 

cliniche multi-istituzionali che indichino come la caratterizzazione 

molecolare delle CTCs possa essere impiegata 

ulteriormente nella pratica clinica. Questo tipo di analisi 

potrebbe fornire informazioni utili nella comprensione 

biologica del processo di metastatizzazione, nella stratificazione 

dei pazienti e, in un futuro, nella caratterizzazione 

di un profilo genetico per ciascun tumore utilizzando le 

CTCs individuate, consentendo in tal modo lo sviluppo di 

trattamenti sempre più personalizzati. 

Qualora i saggi per le CTCs venissero definitivamente 

validati mediante studi prospettici disegnati ad hoc, 

anche attraverso il confronto con i marcatori tumorali 

tradizionali, queste cellule potrebbero effettivamente 

svolgere il ruolo di biomarcatori utili per orientare una 

specifica terapia per il singolo paziente. 

L’analisi del profilo d’espressione genica delle CTCs 

potrebbe fornire una prima stima del rischio di ricaduta, 

alla quale farebbe seguito la possibilità di guidare la scelta 

di agenti terapeutici appropriati. Tutto ciò comporta 

ovviamente anche un aumento sostanziale dei costi della 

terapia, comunque inferiore a quanto richiederebbe una 

programmazione terapeutica eseguita contestualmente 

alla diagnosi di recidiva o la somministrazione di un trattamento 

adiuvante in un paziente per il quale quest’ultimo 

non fosse indicato o necessario. 

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Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011


in cellule di neuroblastoma umano 

LAMINA NUCLEARE E LAMINE 

Nelle cellule eucariotiche il nucleo è un grande organello 

che ospita il materiale genetico ed è separato dal citoplasma 

da una membrana nucleare - nota come involucro 

nucleare (NE) - che consiste di due foglietti, uno interno 

e uno esterno, separati da uno spazio che varia dai 10 ai 

50 nanometri (Fig. 1). La membrana nucleare esterna 

(ONM) è continua con la membrana del reticolo endoplasmatico 

rugoso (RER) ed è costellata da piccole aperture 

chiamate pori nucleari che consentono la circolazione 

di molecole selezionate dall’interno all’esterno 

del nucleo e viceversa. Infatti, l’NE agisce come una barriera 

selettiva controllando il traffico di macromolecole, 

tra cui proteine ed RNA. La membrana nucleare interna 

(INM) è rivestita da un complesso reticolo di proteine, le 

lamine nucleari, che formano i cosiddetti filamenti intermedi 

della lamina nucleare (NL). 

Le lamine si suddividono in due tipi, A e B, sulla base di 

omologie di sequenza. Nei mammiferi sono state carat- 

Giovanna Maresca e Igea D’Agnano 

CNR-Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia, Roma. 

e-mail: igea.dagnano@cnr.it 

terizzate due principali lamine di tipo A (Lamina A e C) 

e due principali lamine di tipo B (Lamina B1 e B2), 

anche se sono state identificate altre isoforme minori 

come la Lamina A∆10, le Lamine C2 specifiche delle 

cellule germinali e la Lamina B3. Le lamine di tipo B 

sono codificate da geni diversi, mentre le lamine A e C 

derivano da un unico gene, LMNA (localizzato sul cromosoma 

1q21.2-q21.3), dal quale vengono generate le 

due lamine per splicing alternativo in quantità molto 

simili (Broers et al., 2006). Il promotore del gene LMNA 

presenta diversi motivi regolatori tra cui un elemento 

responsivo all’acido retinoico, siti di legame per vari fattori 

di trascrizione come c-Jun, c-Fos e Sp1 / 3 (Okumura 

et al., 2004) o coattivatori trascrizionali come la CREBbinding 

protein (Janaki and Parnaik, 2006). Le lamine 

prima di essere incorporate nel network esistente della 

NL subiscono dei processi di maturazione posttraduzionale 

alla terminazione carbossilica, fra cui fosforilazioni, 

farnesilazioni e sumoilazioni (Prokocimer et 

Fig. 1. Principali componenti dell’NE di cellule di mammifero. L’NE è costituito da una membrana nucleare esterna, contigua con il reticolo 

endoplasmatico rugoso e rivestita di ribosomi, e da una membrana nucleare interna, contenente proteine integrali di membrana. Lo 

spazio tra le due membrane viene definito come lo spazio perinucleare. Le due membrane che insieme compongono l’involucro 

nucleare, sono attraversate da pori che regolano il trasporto di materiali tra il nucleo e il citoplasma. Subito al disotto della membrana 

nucleare interna si trova la lamina nucleare, una fitta rete filamentosa, i cui componenti principali sono le lamine nucleari di tipo A e B, 

che rappresentano un gruppo di proteine filamentose che interagiscono sia con le proteine della membrana interna che con la cromatina 

nucleare. Da: Stephen L. Maidment e Juliet A. Ellis, The major architectural components of the mammalian nuclear envelope, Expert 

Reviews in Molecular Medicine, 2002, modificato. 

Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011 ATTIVITÀ SCIENTIFICA 13

14 

al., 2009). Le lamine si presentano normalmente sotto 

forma di dimeri che si associano in polimeri. Durante la 

mitosi le molecole di lamine sono disassemblate in 

monomeri per consentire la rottura del NE, ma subito 

dopo la mitosi esse si riassemblano in strutture più organizzate. 

Durante lo sviluppo le lamine di tipo B sono 

costitutivamente espresse in tutte le cellule mentre 

l’espressione delle lamine di tipo A è regolata e varia in 

relazione allo stadio di differenziamento tissutale (Rober 

et al., 1989); in particolare questa regolazione è stata ben 

caratterizzata nei processi di differenziamento muscolare 

(Frock et al., 2006) e adipocitico (Lloyd et al., 2002). 

LE LAMINE SONO COINVOLTE IN MOLTE 

FUNZIONI NUCLEARI 

La principale funzione della NL è dare supporto all’NE, 

determinando in gran parte la forma complessiva del 

nucleo interfasico. La NL contribuisce a mantenere le 

proprietà meccaniche dell’intera cellula formando non 

solo un complesso network subito al disotto dell’NE, ma 

anche costituendo un ponte fra il nucleo e la membrana 

plasmatica attraverso il citoscheletro (Houben et al., 

2007). Ne è prova il fatto che una carenza di Lamina A/C 

causa una riduzione della rigidità meccanica del nucleo, 

con indebolimento dei processi di meccano-trasduzione, 

probabilmente dovuti a modificazioni delle connessioni 

fra nucleo-scheletro e cito-scheletro cui partecipano proteine 

integrali sia della INM che della ONM (Ketema et 

al., 2007). 

I molti ruoli delle lamine sono mediati dalle loro dirette 

o indirette interazioni con numerose proteine sia alla 

periferia nucleare che nel nucleoplasma quali ad es. i 

dimeri di proteine istoniche H2A/H2B, la proteina retinoblastoma 

(Rb), LAP-2α, kinasi quali Erk-1/2, l’actina 

nucleare, la PCNA e proteine del poro nucleare 

(Hutchison, 2002). Diverse evidenze indicano che le 

lamine sono anche necessarie per l’attività di replicazione 

del DNA ad es. per una corretta localizzazione di fattori 

di replicazione quali PCNA, durante la fase di elongazione 

della replicazione del DNA (Moir et al., 2000). 

Le lamine hanno anche un ruolo nel controllo epigenetico 

dell’espressione genica poiché regolano lo stato della 

cromatina nucleare. E’ riportato che le lamine leghino 

direttamente, attraverso la terminazione carbossilica, o 

indirettamente, attraverso il legame con proteine associate, 

l’eterocromatina (Schirmer and Foisner, 2007). 

Infatti, nei mammiferi l’eterocromatina è altamente organizzata 

e strettamente associata alla lamina nucleare alla 

periferia del nucleo; al contrario, le regioni di cromatina 

attivamente trascritte (eucromatina) sono distribuite in 

modo casuale nel nucleoplasma (Francastel et al., 2000). 

Recentemente, è stato proposto un modello di architettura 

nucleare in cui le lamine risultano essere fattori determinanti 

per il posizionamento dei cromosomi nel nucleo 

(Reddy et al., 2008). Ad un livello più globale le lamine 

possono influenzare l’espressione genica anche perchè 


forniscono un’impalcatura strutturale per l’organizzazione 

dei complessi trascrizionali regolati solo dalla 

RNA polimerasi II (Spann et al., 2002). 

E’ stato anche descritto che le lamine di tipo A possono 

interagire con i fattori di trascrizione in diversi modi: 

sequestrandoli in complessi inattivi a livello dell’involucro 

nucleare, alterandone le modificazioni post-traduzionali 

che sono importanti per la loro funzione e regolando 

i complessi trascrizionali (Andres and Gonzalez, 2009). 

LAMINE E STAMINALITA’ 

La connessione fra le lamine e la staminalità è un dato di 

più recente acquisizione. A differenza delle lamine di 

tipo B che sono espresse in maniera ubiquitaria in tutte le 

cellule e i tessuti di mammifero durante tutto lo sviluppo, 

le lamine di tipo A non vengono espresse in cellule staminali 

embrionali indifferenziate sia umane che murine, anzi 

la loro assenza è considerata un marcatore delle cellule 

staminali indifferenziate (Constantinescu et al., 2006; 

Takamori et al., 2007). E’ infatti riportato che in cellule 

embrionali staminali indifferenziate dove la Lamina A/C è 

assente, la struttura della lamina nucleare è diffusa e 

dispersa, a differenza di cellule parzialmente differenziate 

che esprimono invece Lamina A/C (Meshorer and Misteli, 

2006). La presenza di una struttura cromatinica più flessibile 

potrebbe essere necessaria al mantenimento dello 

stato di pluripotenza. Inoltre, vi sono già diversi esempi 

che dimostrano il coinvolgimento delle lamine di tipo A 

nella regolazione del differenziamento di cellule staminali 

somatiche, influenzando pathways molecolari importanti 

nelle cellule staminali. Le cellule staminali somatiche, a 

differenza delle embrionali pluripotenti e altamente proliferative, 

sono cellule staminali tessuto-specifiche che presentano 

una bassa capacità di self-renewing, ma che possono 

venire facilmente attivate a differenziare, andando 

così a costituire una importante riserva di cellule somatiche 

che possono sia reintegrare costantemente i tessuti, 

come nel caso dell’intestino, sia produrre nuovo tessuto 

quando necessario, specialmente in seguito a danno. I 

principali pathways di segnale intracellulare che operano 

in diverse nicchie di cellule staminali somatiche sono 

essenzialmente quattro, Notch, Wnt, TGF-β e Sonic hedgehog 

(Lowry and Richter, 2007). L’attivazione di questi 

pathways è stata correlata con mutazioni o variazioni 

d’espressione delle lamine di tipo A (Espada et al., 2008). 

LAMINOPATIE 

Diverse funzioni nucleari e citoplasmatiche sono 

influenzate da modificazioni dell’NE e della NL. La 

distruzione della struttura della NL, l’over-espressione di 

lamine mutanti o tronche e la presenza di mutazioni inattivanti 

nel gene LMNA, codificante per lamine di tipo A, 

causano importanti alterazioni di processi fondamentali 

quali la replicazione del DNA, la trascrizione e la 

sopravvivenza cellulare. Data l’ampia varietà di funzioni 

affette da tali alterazioni, non stupisce riscontrare una 


vasta casistica di patologie umane che colpiscono diversi 

tessuti legate a difetti nelle lamine. Al momento non 

sono note malattie umane legate a mutazioni nelle lamine 

di tipo B. Al contrario, diverse malattie umane note 

con il nome di “laminopatie”sono direttamente associate 

ad alterazioni nelle lamine di tipo A. Esse sono classificate 

in laminopatie primarie, se associate a mutazioni nel 

gene LMNA, e laminopatie secondarie, se causate da 

mutazioni nel gene ZMPSTE-24, codificante per un enzima 

richiesto per le modificazioni post-traduzionali delle 

lamine di tipo A (Ben et al., 2005). 

Le laminopatie primarie sono classificate in cinque gruppi. 

Gruppo 1. E’ il gruppo più frequente e comprende malattie 

del muscolo scheletrico e cardiaco, tra cui la distrofia 

muscolare di Emery Dreifuss (AD-EDMD), autosomica 

dominante, e la cardiomiopatia dilatativa con malattia 

del sistema di conduzione (DCM-CD1). Al momento il 

60% delle laminopatie è costituito da distrofie del 

muscolo scheletrico. 

Gruppo 2. Fanno parte di questo gruppo malattie del tessuto 

adiposo e/o scheletrico, quali la lipodistrofia parziale 

familiare di Dunnigan (FPLD), dovuta ad una mutazione 

missenso nel gene LMNA e la displasia mandiboloacrale 

(MAD), legata a mutazioni autosomiche recessive 

nel dominio C-terminale delle lamine di tipo A. 

Group 3. Il terzo gruppo è costituito da un’unica malattia, 

la syndrome di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2b, causata 

da una mutazione autosomico-recessiva nelle lamine 

di tipo A che causa neuropatia periferica associata a 

demielinizzazione dei motoneuroni. 

Group 4. Il quarto gruppo comprende malattie dell’invecchiamento 

precoce, quali la progeria di Hutchinson 

Gilford (HGPS) e alcuni casi della syndrome atipica di 

Werner. In particolare la HGPS è causata da un difetto di 

splicing del gene LMNA e causa la formazione di una 

Lamina A tronca, detta Progerina. 

Group 5. Nel quinto gruppo si ritrovano sindromi eterogenee 

che colpiscono diversi tessuti e che spesso presentano 

fenotipi sovrapposti tra quelli delle malattie dei 

gruppi precedenti. 

Attualmente sono state individuate oltre 200 mutazioni 

del gene LMNA da più di 1000 individui. E’ possibile 

consultare sul sito http://www.umd.be un database sulle 

malattie dell’involucro nucleare. 

LAMINE E TUMORI 

L’espressione delle lamine di tipo A è spesso ridotta o 

assente in cellule a basso grado di differenziamento e/o 

cellule altamente proliferanti, tra cui cellule tumorali 

umane, in particolare leucemie, linfomi, alcuni tumori 

della pelle, carcinoma delle cellule basali e squamose, 

adenocarcinoma dello stomaco e del colon, adenocarcinoma 

dell’esofago, tumore polmonare a piccole cellule, 

tumori delle cellule germinali testicolari e tumori prostatici 

(Prokocimer et al.,2009). 

Un’alterata espressione e un’aberrante localizzazione delle 

lamine di tipo A spesso sono correlate con il sottotipo tumorale, 

il grado di aggressività, la capacità proliferativa e lo 

stadio di differenziamento. Una perdita di espressione delle 

lamine di tipo A nei tumori non dovrebbe sorprenderci, dato 

che la progressione tumorale spesso si associa alla regressione 

da un fenotipo più differenziato ad uno meno maturo. 

Tuttavia, sebbene il fatto che tale perdita stia emergendo 

come un evento implicato nella trasformazione e nella progressione 

tumorale, il loro ruolo nella tumorigenesi non è 

stato ancora caratterizzato né è stato scoperto quale sia il 

difetto molecolare che porti alla mancanza delle Lamine A 

in molti tumori umani. 

E’ stato riportato che l’ipermetilazione del promotore del 

gene LMNA nelle isole CpG sia significativamente predittivo 

di cattiva prognosi in alcuni linfomi (Agrelo et 

al., 2005). I tumori possono essere considerati anche 

come malattie epigenetiche in cui si riscontrano ampie 

zone di metilazione aberrante del DNA. Ciò causa silenziamento 

genico quando la metilazione colpisce le isole 

CpG dei promotori dei geni ed è un evento che spesso 

accade nei tumori. Poichè le lamine di tipo A hanno un 

importante ruolo sia nel proteggere la cromatina dal 

danno, sia nel regolare la trascrizione genica, il silenziamento 

epigenetico del gene LMNA in tumori ematologici 

può far comprendere come un’alterazione delle lamine 

possa contribuire alla trasformazione cellulare. 

Inoltre la Lamina A/C è stata indicata come un marcatore 

del differenziamento muscolare e adipocitico (Frock 

et al., 2006; Lloyd et al., 2002). 

La Lamina A/C, infatti, funge da “scheletro” del nucleoplasma, 

sia per l’ancoraggio della cromatina alla lamina 

nucleare, sia nell’organizzazione dei complessi trascrizionali 

dell’RNApolII (Reddy et al., 2008); sia per 

l’interazione con diversi fattori di trascrizione (Andres 

and Gonzalez, 2009). 

CARATTERIZZAZIONE CITOMETRICA DELLE 

LAMINE A/C IN DUE LINEE CELLULARI DI 

NEUROBLASTOMA UMANO 

Materiali e metodi 

Colture cellulari 

Abbiamo utilizzato due linee cellulari di neuroblastoma 

umano, SH-SY5Y e LAN-5, chiamate di seguito linea A 

e linea B, rispettivamente. Le cellule SH-SY5Y sono 

state mantenute in mezzo di coltura costituito in quantità 

uguali da Eagle’s Minimum Essential Medium ed F12 

(Gibco), mentre le cellule LAN-5 sono state mantenute 

in mezzo di coltura RPMI-1640 (Gibco). Ad entrambi i 

mezzi di coltura sono stati aggiunti: 10% siero fetale 

bovino (FBS, Hyclone), 2 mM L-glutamina, 0.5% aminoacidi 

non essenziali, 0.5% piruvato di sodio e 1% antibiotici. 

Le cellule sono state cresciute in un incubatore 

umidificato contenente 5% CO 2 a 37˚C. In ogni esperimento 

sono state utilizzate cellule in fase esponenziale di 

crescita (3° giornata). 


16 

Espressione e localizzazione della Lamina A/C 

L’espressione nucleare della Lamina A/C è stata analizzata 

mediante immunofluorescenza indiretta in citometria 

a flusso. Cellule delle due diverse linee cellulari sono 

state raccolte in tripsina e dopo un lavaggio in PBS 1X, 

sono state fissate in una soluzione acetone/metanolo 1:4 

vol/vol (conservato a -20 °C) al 50% in PBS, alla concentrazione 

di 1x10 6 cellule/ml e conservate per 24 h a 

+4 °C. 1x10 6 cellule fissate sono state centrifugate 

(microcentrifuga 1500 rpm) per rimuovere il fissativo e 

lavate una volta in PBS addizionato con 0.5% BSA a temperatura 

ambiente. Le cellule sono state incubate per 5 min 

a temperatura ambiente in una soluzione di PBS+0.5% 

BSA+0.5% Tween 20 per ottenere la permeabilizzazione 

della membrana plasmatica. La sospensione cellulare è stata 

quindi centrifugata ed il pellet incubato con l’anticorpo primario 

anti-lamina A/C (goat-N18, S.Cruz) diluito 1:10 in 

PBS+2% BSA+0.5% Tween 20 (50 µl) per 1 h a temperatura 

ambiente. Nel campione di controllo negativo sono 

state aggiunte immunoglobuline dello stesso isotipo dell’anticorpo 

primario, alla stessa concentrazione. Dopo 

l’incubazione con l’anticorpo le cellule sono state lavate 2 

volte in PBS+0.5% BSA+ 0.5% Tween 20. Quindi i campioni 

sono stati incubati con l’anticorpo secondario F(ab’)2 

anti-goat coniugato con ficoeritrina, alla diluizione 1:50 in 

PBS+2% BSA+ 0.5% Tween 20, per 45 min a temperatura 

ambiente e al buio. Successivamente le cellule sono state 

lavate 3 volte in PBS+0.5% BSA+0.5% Tween 20 e risospese 

in PBS. I campioni sono stati quindi misurati utilizzando 

il citofluorimetro FACScan (BD). Sono stati memorizzati 

10.000 eventi per ciascun campione utilizzando il 

software CellQuest (BD). Per verificare la specificità dell’anticorpo 

utilizzato è stato condotto un western blot di 

controllo seguendo un protocollo precedentemente pubblicato 

(Gatti et al., 2009). 

La localizzazione intracellulare della Lamina A/C è stata 

analizzata su vetrino mediante microscopia a fluorescenza. 

Cellule cresciute su vetrini da microscopia sono state 

lavate 3 volte in PBS+Ca/Mg, quindi fissate in metanolo 

assoluto per 10 min a – 20 °C. Dopodichè i campioni 

sono stati lavati 2 volte in PBS+Ca/Mg per 10 min. Per 

bloccare i siti aspecifici i campioni sono stati incubati in 

PBS+Ca/Mg+5% NFM+0.1% Tween 20 per 30 min. 

Dopo un rapido lavaggio in PBS+Ca/Mg+0.3% 

BSA+0.1% Tween 20 i vetrini sono stati incubati con 

l’anticorpo anti-lamina A/C (mouse-Jol2, Chemicon) 

diluito 1:10 in PBS+Ca/Mg+0.2% BSA+0.1% Tween 20 

per 1h e 30 min. I campioni sono stati quindi lavati 3 

volte in PBS+Ca/Mg+0.3% BSA+0.1% Tween 20 e 

incubati con l’anticorpo secondario anti-mouse Alexa 

594 alla diluizione 1:250 in PBS. I campioni sono stati 

lavati 3 volte in PBS+Ca/Mg+0.3% BSA+0.1% Tween 

20 per 10 min. I nuclei sono stati controcolorati con 

DAPI in PBS per 5 min, quindi lavati 3 volte in 

PBS+Ca/Mg per 5 min. Dopo un rapido passaggio in 

acqua bidistillata i vetrini sono stati montati su portaog- 


getto con reagente ProLong Gold anti-Fade (Molecular 

Probes). Ciascun campione è stato poi analizzato con un 

microscopio a fluorescenza Olimpus BX51. 

Espressione di CD133 

L’espressione di superficie del CD133 è stata analizzata 

mediante immunofluorescenza indiretta in citometria a 

flusso. Cellule delle due diverse linee cellulari sono state 

raccolte in PBS-EDTA0.002%, lavate in tampone di 

lavaggio (PBS 1X+10 mM NaN3+0.002% EDTA) a + 4 

°C. 1x10 6 cellule di ciascun campione sono state aliquotate 

in provette eppendorf e centrifugate. Il pellet incubato 

nella soluzione di anticorpo anti-CD133/2 (mouse- 

293C3, Miltenyi Biotec) diluito 1:20 in mezzo di coltura 

completo di siero fetale bovino 10%. Il campione di riferimento 

negativo è stato incubato con immunoglobuline 

di topo alla stessa concentrazione dell’anticorpo primario. 

I campioni sono stati incubati 1h a +4 °C con 

l’anticorpo e quindi lavati 2 volte con 500 µl di tampone 

di lavaggio. I campioni sono stati successivamente incubati 

con l’anticorpo secondario anti-mouse coniugato 

con ficoeritrina diluito 1:20 in tampone di lavaggio per 

30 min a +4 °C al buio. I campioni lavati 2 volte in tampone 

di lavaggio sono stati risospesi in 500 µl tampone 

di lavaggio e misurati con il citofluorimetro FACScan 

(BD) come sopra descritto. 

L’espressione del gene PROM1 (unigene Hs.614734) 

codificante per CD133 è stata valutata mediante real 

time PCR come descritto in un precedente lavoro (Natoli 

et al., 2011). Sono stati utilizzati i seguenti oligo: F: 

TCCACAGAAATTTACCTACATTGG and R: CAG- 

CAGAGAGCAGATGACCA 

Analisi della proliferazione cellulare 

L’analisi della proliferazione delle due linee cellulari 

SH-SY5Y (A) e LAN-5 (B) è stata condotta valutando la 

frazione di sintesi mediante incorporazione di bromodesossiuridina 

e stimando la distribuzione delle cellule 

nelle diverse fasi del ciclo cellulare con l’applicazione di 

un modello matematico agli istogrammi del contenuto di 

DNA. I due tipi di esperimento sono stati condotti come 

descritto in lavori precedenti (Gatti et al., 2009). 

Risultati e Discussione 

Le due linee cellulari di neuroblastoma SH-SY5Y (linea 

A) e LAN-5 (linea B) sono state inizialmente caratterizzate 

per l’espressione della Lamina A/C (Fig. 2a). Le cellule 

SH-SY5Y mostrano livelli elevati d’espressione 

della lamina come evidenziato dall’analisi citofluorimetrica 

(percentuale di positività = 94%); al contrario la 

linea LAN-5 risulta essere completamente negativa. 

Trattandosi della rilevazione di una molecola intracellulare 

abbiamo anche verificato la specificità dell’anticorpo 

utilizzato mediante un’analisi dell’espressione proteica 

in western blotting. Come mostrato in Fig. 2b 

l’anticorpo utilizzato per la rilevazione della Lamina A/C 


isulta essere altamente specifico per questa proteina. 

Abbiamo voluto studiare quindi la distribuzione intracellulare 

della Lamina A/C e come atteso l’analisi condotta 

in microscopia a fluorescenza mostra una distribuzione 

perinucleare della proteina nelle cellule SH-SY5Y (Fig. 

2c). Questo risultato conferma la presenza della Lamina 

A/C a livello dell’involucro nucleare dove, come è noto, 

svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della 

struttura nucleare (Prokocimer et al., 2009). 

Per evidenziare una eventuale relazione fra espressione di 

Lamina A/C e livello di maturazione delle due linee cellulari 

di neuroblastoma abbiamo analizzato l’espressione di 

un noto marcatore di staminalità, la proteina CD133, nei 

due tipi cellulari (Fig. 3a). L’analisi al FACS dell’espressione 

di CD133 mostra una evidente e significativa differente 

espressione fra le due linee. Infatti, la linea SH- 

SY5Y (A), che esprime elevati livelli di Lamina A/C, 

risulta essere completamente negativa per l’espressione 

del CD133 suggerendo la presenza di uno stato di maturazione 

più avanzato in queste cellule. Al contrario la linea 

LAN-5 (B), che invece non esprime Lamina A/C, mostra 

una percentuale di positività per CD133 pari a circa il 

90%. Questo risultato suggerisce una stretta relazione fra 

stato di maturazione cellulare ed espressione della Lamina 

A/C ed è confermato dalla capacità delle cellule non-esprimenti 

Lamina A/C di dar luogo alla formazione di tumorsfere, 

saggio utilizzato per la valutazione della staminalità 

della popolazione cellulare in vitro. A conferma di ciò, 

molti autori hanno dimostrato che le lamine di tipo A non 

sono presenti in cellule che esprimono le caratteristiche 

delle cellule staminali (Constantinescu et al., 2006). Per 

valutare se la regolazione dell’espressione di CD133 fosse 

a livello trascrizionale abbiamo studiato l’espressione del 

gene PROM1, codificante per CD133. I risultati ottenuti 

con PCR quantitativa mostrano che l’espressione del gene 

correla con l’espressione della proteina. Infatti, le cellule 

LAN-5, che esprimono la proteina CD133 in circa il 90% 

della popolazione, mostrano livelli 20 volte superiori del 

gene PROM1 rispetto alla linea SH-SY5Y, negativa per 

CD133. 


Fig. 2 . Espressione di lamina A/C in due linee cellulari di 

neuroblastoma umano (A e B). a) Immunofluorescenza in 

FACS della Lamina A/C. L’istogramma colorato in blu 

rappresenta il campione test incubato con l’anticorpo 

specifico per Lamina A/C; l’istogramma colorato in bianco 

rappresenta il campione di controllo negativo incubato 

con l’isotipo corrispondente dell’anticorpo primario 

specifico per Lamina A/C. b) verifica della specificità 

dell’anticorpo per Lamina A/C utilizzato in a) mediante 

western blot. L’espressione di GAPDH è stata utilizzata 

come controllo per il caricamento della quantità di proteine 

su gel di acrilamide. c) Immunofluorescenza su vetrino 

della Lamina A/C dopo fissazione in metanolo. In 

rosso la Lamina A/C; in blu i nuclei controcolorati con 

DAPI. E’ evidente la distribuzione perinucleare della 

lamina A/C nella linea A. 

L’analisi della proliferazione cellulare correla con la 

diversa espressione del CD133 nelle due linee cellulari. 

Le cellule SH-SY5Y, che mostrano un livello di maturazione 

più avanzato rispetto alle LAN-5, presentano 

anche uno livello di proliferazione più basso. Infatti, la 

frazione di cellule in grado di incorporare bromodesossiuridina 

è pari a circa il 20% nelle cellule SH-SY5Y e 

circa il 40% nelle LAN-5. Ciò è evidenziato anche dall’analisi 

globale del ciclo cellulare in quanto ad una più 

ridotta percentuale di cellule in fase S nelle cellule SH- 

SY5Y si associa una concomitante più elevata percentuale 

di cellule in fase G0/G1, suggerendo la presenza di un 

più elevato stato di quiescenza in tale linea cellulare. E’ 

anche possibile che la presenza di Lamina A/C determini 

una maggiore predisposizione al differenziamento cellulare. 

Queste linee cellulari di neuroblastoma hanno 

mantenuto la capacità di differenziare in vitro e costituiscono 

un buon modello per lo studio del differenziamento 

neuronale (Edsjo et al., 2007). Nel nostro laboratorio 

abbiamo recentemente dimostrato (Maresca et al. submitted) 

che l’espressione della LAMINA A/C aumenta 

durante il differenziamento indotto da acido retinoico 

nella linea di neuroblastoma SH-SY5Y. I nostri risultati 

concordano con diversi studi condotti sullo sviluppo 

embrionale di Xenopus, Drosophila e pollo, nei quali la 

composizione della lamina nucleare varia a seconda del 

differenziamento cellulare (Stick and Hausen, 1985; 

Lehner et al., 1987; Riemer et al., 1995). Diversi autori 

mostrano anche come nei mammiferi l’espressione delle 

lamine di tipo A sia regolata a seconda del grado di sviluppo 

tissutale. (Rober et al., 1989; Lin and Worman, 

1997). Uno studio più recente ha dimostrato come 

l’espressione della lamina A/C sia un indicatore precoce 

del differenziamento proprio in cellule staminali embrionali 

(Constantinescu et al., 2006). 

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17

Fig. 3. a) Espressione di CD133 in due linee cellulari di neuroblastoma esprimenti (A) o no (B) Lamina A/C. Le cellule sono state 

incubate con un anticorpo diretto verso un epitopo esterno di CD133 e analizzate al FACS. Neg = controllo negativo, campione incubato 

con immunoglobuline dello stesso isotipo dell’anticorpo primario; Pos = campione positivo, incubato con anticorpo primario specifico. 

Entrambi i campioni sono stati incubati con un anticorpo secondario coniugato con ficoeritrina per la rilevazione della fluorescenza. 

b) Espressione del gene PROM1, codificante per la proteina CD133 mediante real time PCR. RQ = quantificazione relativa 

considerando come riferimento la linea cellulare A che non esprime il gene. In basso sono riportate le immagini microscopiche in contrasto 

di fase che mostrano in ciascuna linea cellulare la formazione di tumorsfere. 

Fig. 4 . Analisi della proliferazione cellulare in due linee cellulari di neuroblastoma umano esprimenti (A) o no (B) Lamina A/C. 

a) Incorporazione di bromodesossiuridina (BrdU) analizzata al FACS. Le percentuali di cellule in fase di sintesi (S) sono 19% per la linea 

A e 40% per la B. b) percentuali delle cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare stimate mediante l’applicazione di un modello matematico 

all’istogramma del contenuto di DNA ottenuto in seguito a colorazione delle cellule con ioduro di propidio e analisi al FACS.

lamin A/C gene by CpG island promoter hypermethylation 

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19

Autofagia e stress ossidativo nella malattia di Niemann-Pick 

Valutazione dell’induzione di autofagia nella risposta 

di linfociti b asmasi-/- allo stress ossidativo mediante 

citometria a flusso 

E. Cesarini, B. Canonico, M. Arcangeletti, L. Galli, S. Papa, F. Palma and F. Luchetti 

Dipartimento di Scienze della Terra, della Vita e dell’Ambiente (DiSTeVA), 

Università degli Studi di Urbino “Carlo Bo”, Urbino 

La malattia di Niemann-Pick di tipo A/B 

Le malattie da accumulo lisosomiale (LSD: Lysosomal 

Storage Disorder) sono un gruppo di circa 60 patologie 

ereditarie causate da perdita di funzione di specifici enzimi 

o proteine lisosomiali comportando un accumulo 

intracellulare di macromolecole non degradate nel compartimento 

endo-lisosomiale. Tra di esse, la malattia di 

Niemann-Pick (NPD) di tipo A/B è una malattia ereditaria 

a trasmissione autosomica recessiva causata da 

un’insufficiente attività della sfingomielinasi acida (A- 

SMasi) e caratterizzata da accumulo di sfingomielina e 

altri lipidi all’interno del compartimento lisosomiale 

(Schuchman & Desnick, 2001). Questo difetto enzimatico 

è geneticamente determinato da mutazioni con perdita 

di funzione a livello del gene SMPD1. La Niemann- 

Pick di tipo A (NPA) è una grave forma neuropatica 

acuta infantile, solitamente fatale entro i tre anni, mentre 

il tipo B (NPB), spesso compatibile con la vita adulta, 

presenta un coinvolgimento neurologico minimo o 

assente, ma mostra severe e progressive anormalità 

viscerali, tra cui epatosplenomegalia, insufficienza polmonare 

e problemi cardiovascolari. Le differenti presentazioni 

cliniche dei tipi A e B sono dipendenti dall’attività 

enzimatica residua (Graber et al., 1994). Molte delle 

manifestazioni fenotipiche nella NPD sono correlate 

all’accumulo lipidico nei lisosomi ma dati recenti rivelano 

un importante ruolo della A-SMasi nella formazione 

e funzione della membrana plasmatica, nonché nei 

signaling cellulari. Il ruolo della A-SMasi nel signaling 

cellulare è strettamente collegato alla sua abilità di riorganizzare 

la membrana plasmatica. Infatti, gli sfingolipidi, 

in particolar modo la sfingomielina e la ceramide, 

rappresentano costituenti fondamentali delle membrane 

plasmatiche e delle guaine mieliniche, con capacità di 

incrementare il livello di ‘ordine’ di regioni isolate di 

membrana. 

Autofagia e malattie neurodegenerative 

La ceramide risulta anche implicata nella macroautofa- 

e-mail: erica.cesarini@uniurb.it 

gia (generalmente sinonimo di autofagia), un processo 

lisosomiale di degradazione e riciclo di costituenti cellulari, 

caratterizzato dalla formazione di vacuoli a doppia 

membrana chiamati autofagosomi. L’autofagosoma origina 

da una struttura a doppia membrana isolata denominata 

fagoforo, la quale inizia a estendersi ad entrambe le 

estremità ed infine si chiude, intrappolando citoplasma e 

organelli, formando così l’autofagosoma. In seguito la 

fusione di questo vacuolo a doppia membrana con i lisosomi, 

a formare l’autolisosoma, porta il materiale autofagocitato 

a contatto con gli enzimi lisosomiali causandone 

la degradazione (Klionsky & Emr, 2000; 

Mizushima et al., 2008). Questo evento di fusione può in 

alcuni casi essere preceduto da uno step in cui 

l’autofagosoma si fonde con le vescicole endosomiali 

(formando l’amfisoma) e poi successivamente con i 

lisosomi (Fig. 1). Il termine “vacuoli autofagici” è utilizzato 

in riferimento ad autofagosomi, amfisomi e autolisosomi. 

In condizioni fisiologiche l’autofagia gioca un ruolo 

nella gestione bioenergetica in caso di carenza di nutrienti. 

Attivata da condizioni di stress, l’autofagia può promuovere 

la sopravvivenza cellulare o la morte cellulare 

a seconda del tipo e dell’entità dello stimolo. Infatti, 

durante lo stress ossidativo, l’induzione dell’autofagia 

consente l’efficace rimozione di organelli e di proteine 

danneggiate dall’ambiente citoplasmatico, agendo come 

meccanismo di sopravvivenza. Tuttavia, quando prolungata 

o over-espressa, essa può contribuire alla morte 

della cellula (morte cellulare programmata di tipo II o 

autofagica) (Ferraro & Cecconi, 2007). L’autofagia può 

essere indotta da diversi tipi di stress cellulari quali la 

deplezione di aminoacidi (starvation). Questa induzione 

è mediata attraverso i signaling di mTOR (mammalian 

Target Of Rapamycin) e del complesso PI3K ClasseIII- 

Beclin1 (Klionsky & Emr, 2000). mTOR è un modulatore 

negativo di autofagia, attivato da aminoacidi e inibito 

farmacologicamente dalla rapamicina. Il complesso 

PI3K ClasseIII-Beclin1 è necessario per l’induzione 

Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011 ATTIVITÀ SCIENTIFICA 23 23

autofagica e può attivare questo processo indipendentemente 

dall’inibizione di mTOR. 

L’autofagia è necessaria per il normale sviluppo e per la 

funzionalità del sistema nervoso centrale, e disfunzioni 

nella via autofagica sembra contribuiscano anche alla 

patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui 

i disordini da aggregazione proteica, quali l’Huntington, 

l’Alzheimer e il morbo di Parkinson, e le malattie da 

accumulo lisosomiale (LSD). Inoltre uno spegnimento 

dei geni autofagici, atg5 e atg7, nel topo causa un accumulo 

anomalo di proteine ubiquitinate portando, conseguentemente, 

a neurodegenerazione (Rubinsztein, 2006), 

dimostrando che l’autofagia basale contribuisce significativamente 

alla clearance proteica e alla sopravvivenza 

neuronale. L’attivazione farmacologica dell’autofagia 

incrementa, infatti, la rimozione di proteine misfolded o 

mutanti. Quest’aumento sembra abrogare il fenotipo 

malato in sistemi modello, indicando che l’autofagia 

potrebbe avere un effetto benefico in alcune di queste 

patologie neurodegenerative (Williams et al., 2006). 

Sebbene l’induzione autofagica può in alcuni casi alleviare 

la patologia, una eccessiva attivazione del pathway 

può avere effetti negativi in altri (Shintani & Klionsky, 

2004), inducendo ad esempio nel caso delle malattie neurodegenerative, 

morte cellulare neuronale. 

Recentemente, l’interesse verso il pathway autofagico 

nelle LSD è notevolmente aumentato in relazione 

all’ipotesi che l’accumulo nei lisosomi di substrati non 

degradati, dovuto alla deficienza di specifici enzimi lisosomiali, 

potrebbe deteriorare il processo autofagico. 

Infatti, la maturazione degli autofagosomi e la degradazione 

del loro contenuto richiedono la presenza di lisosomi 

funzionanti. Il coinvolgimento dell’autofagia è stato 

dimostrato in molte LSD, tra cui la Niemann-Pick di tipo 

C (NPC), la Mucopolisaccaridosi di tipo IIIA (MPS- 

IIIA), la malattia di Danon e il Deficit Multiplo di 

Solfatasi (MSD: Multiple Sulphatase Deficiency) 

(Settembre et al., 2008; Raben et al., 2009). 

Ad oggi il meccanismo esatto che porta a modificazioni 

o malfunzionamenti del pathway autofagico resta incerto. 

Inoltre, rimane ancora da chiarire il legame tra una 

alterata autofagia e la morte cellulare. Comprendere la 

correlazione tra l’autofagia e queste patologie diventa 

quindi cruciale in quanto l’attivazione di questo processo 

di riciclo mediante l’uso di farmaci quali la rapamicina 

potrebbe offrire una valida strategia terapeutica per un 

certo numero di LSD e di malattie neurodegenerative. 

Inoltre, nel campo delle LSD, sono stati fatti grandi progressi 

per quanto riguarda l’elucidazione dei difetti genetici, 

lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici, il miglioramento 

dell’assistenza ai pazienti, la produzione di 

modelli animali ecc., ma i pathway biologici che vanno 

dall’accumulo lisosomiale alla disfunzione e morte cellulare 

restano in gran parte sconosciuti. Infine rimane 

ancora sconosciuto il meccanismo esatto mediante il 

quale le specie reattive dell’ossigeno (ROS) che si accu- 

mulano in risposta allo stress ossidativo, coinvolto 

anch’esso in condizioni patologiche quali le malattie 

neurodegenerative e le LSD (Barnham et al., 2004; Wei 

et al., 2008), inducano o regolino il processo autofagico 

(Zhang et al., 2009). 

Niemann-Pick A/B, autofagia e stress ossidativo 

Ad oggi, il coinvolgimento autofagico nella malattia di 

Niemann-Pick di tipo A/B non è mai stato valutato. 

Abbiamo quindi esaminato l’induzione del pathway 

autofagico in risposta a stress ossidativo (UVB) in linfociti 

NPD appartenenti a pazienti affetti da Niemann-Pick 

di tipo B, verificando anche l’azione di specifici farmaci, 

induttori (rapamicina) e inibitori (wortmannina, nocodazolo) 

del pathway autofagico, in quanto questo potrebbe 

risultare alterato in punti specifici. La linea cellulare 

GM16193 (linfociti B EBV-transformed) carente dell’enzima 

sfingomielinasi acida, è stata fornita dal Coriell 

Institute di Camden, New Jersey (USA). Le cellule sono 

state coltivate in RPMI con l’aggiunta del 15% di FCS 

(Fetal Calf Serum). Lo stress ossidativo è stato indotto 

mediante l’esposizione a UVB 312nm per 5-10 minuti e 

post-incubazione di 2 ore. Abbiamo valutato vitalità cellulare 

e funzionalità mitocondriale, parametri fondamentali 

da analizzare sia in modelli autofagici che apoptotici. 

Inoltre, è stato dimostrato che disfunzioni nell’autofagia 

inducono un accumulo di mitocondri danneggiati, 

esponendo le cellule ad un aumento dello stress ossidativo. 

La vitalità cellulare è stata misurata mediante 

l’utilizzo di ioduro di propidio e annessina V (Anx-V 

FITC Apoptosis Detection Kit). Inoltre è stata valutata 

l’attivazione delle caspasi tramite il CaspGLOW TM 

Fluorescein Active Caspase Staining Kit (BioVision). 

Per l’analisi mitocondriale abbiamo invece impiegato 

coloranti come TMRE (Tetrametilrodamina etil estere) e 

NAO (arancio di nonil-acridina) utili al fine di valutare 

rispettivamente il potenziale e la massa mitocondriale. 

Per monitorare il processo autofagico e la funzionalità 

del comparto endo-lisosomiale sono stati invece utilizzati 

marcatori vescicolari quali LysoTracker Green e 

Arancio di Acridina due coloranti specifici per la determinazione 

degli organelli a pH acido nelle cellule vitali 

(lisosomi e autolisosomi). Le cellule sono poi state analizzate 

con un citometro FACScan usando il software 

CellQuest. Gli stessi campioni preparati per la citometria 

a flusso sono stati anche osservati e fotografati al microscopio 

rovesciato a fluorescenza Nikon TS100. 

A seguito del trattamento con UV è stata osservata nelle 

cellule una risposta differente in relazione alla durata 

dell’irradiazione (5 e 10 min.). A 5 minuti dall’esposizione 

si osserva la comparsa di circa il 20% di cellule positive 

ad annessina V (Anx V) e 10% positive allo ioduro 

di propidio (PI). Nel campione sottoposto a 10 min. di 

irradiazione, le cellule positive al PI risultano il 22% 

mentre le cellule positive all’Anx V sono il 7% (Fig. 

2A). Per caratterizzare ulteriormente il processo apopto- 

24 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011

Fig. 2A. I Contour Plot ANX V vs PI evidenziano 

gli eventi in apoptosi precoce e tardiva. 2B. 

Istogrammi relativi all’attivazione delle caspasi in 

cellule GM16193 di controllo e UVB-irradiate. 

tico abbiamo investigato l’attivazione delle caspasi (Fig. 

2B), rilevando risultati sovrapponibili all’annessina. 

L’esposizione UV della durata di 5 minuti sembra indurre 

prevalentemente morte per apoptosi, mentre 

un’esposizione più prolungata (10 minuti) potrebbe 

indurre un meccanismo di tipo necrotico, in cui non si 

assiste al coinvolgimento diretto delle caspasi. Grazie 

alle colorazioni con arancio di acridina (AO, Fig. 3) e 

lysotracker (dati non mostrati) abbiamo analizzato il 


Fig. 1. Rappresentazione schematica del 

processo autofagico (Klionsky, 2007). 

Fig. 3. Le immagini di microscopia a fluorescenza mostrano l’uptake del marcatore 

vescicolare arancio di acridina (AO) in cellule di controllo, irradiate 

UVB per 10’, trattate con l’inibitore autofagico nocodazolo (NZ) e con nocodazolo 

+ UVB (NZ+UV10’). 

compartimento endolisosomiale, evidenziando un notevole 

aumento di positività per AO nei campioni irradiati, 

in particolare a seguito del trattamento di 10 minuti 

(UV10’± nocodazolo). Ciò suggerisce un aumento di 

volume del compartimento acido (lisosomi e autolisosomi) 

e/o una sua significativa riduzione di pH. La maggiore 

presenza di vacuoli nei campioni irradiati rivelata 

dalla microscopia a fluorescenza (e dalla microscopia a 

trasmissione, dati non mostrati) suggerisce la coesisten- 


25

Fig. 4A. Istogrammi relativi al contenuto di cardiolipine mitocondriali 

in cellule di controllo, irradiate UVB per 10’, trattate 

con rapamicina (RM) e con rapamicina + UVB (RM + UV10’). 

4B. Grafico relativo alle MFI (NAO) riscontrate nei singoli 

punti sperimentali (esperimento rappresentativo). 

za, all’interno della stessa cellula, di morte cellulare 

(apoptosi o necrosi in relazione all’intensità dello stimolo) 

e autofagia. 

Per quanto riguarda la colorazione mediante NAO (Fig. 

4A-B), i linfociti trattati con gli inibitori mostravano 

MFI paragonabili al controllo, mentre è stato osservato 

un incremento del 20% nel campione pretrattato con 

rapamicina (± UV10’). 

Questi dati potrebbero suggerire la rapamicina come farmaco 

per un ripristino almeno parziale del processo 

autofagico e rendere la cellula in grado di smaltire gli 

storage lisosomiali. 

Ringraziamenti 

Si ringrazia l’Associazione Italiana Niemann-Pick 

ONLUS per aver finanziato questo lavoro. 

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Applicazione della Citometria a flusso nella diagnosi 

delle sindromi mielodisplastiche 

Cristina Picone, 1 Francesco Lanza, 2 Luigi Del Vecchio, 3 

Matteo Giovanni Della Porta, 1* (Società Italiana di Citometria, GIC) 

1Dipartimento di Ematologia e Oncologia, Università di Pavia e Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, 

2Sezione di Ematologia e Trapianto di Midollo Osseo, Ospedale di Cremona, Cremona, 3CEINGE, Biotecnologie 

Avanzate, e Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie, Università Federico II, Napoli, Italy 

LA DIFFICOLTÀ DELLA DIAGNOSI DELLE 

SINDROMI MIELODISPLASTICHE 

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) sono un gruppo di 

disordini clinicamente caratterizzati da citopenia periferica, 

e da un aumentato rischio di evoluzione in leucemia 

acuta. Il decorso clinico della malattia è molto eterogeneo,variando 

da forme indolenti che si estendono per 

anni a forme che rapidamente progrediscono in leucemia. 

Tale eterogeneità riflette la complessità dei difetti 

genetici alla base della patologia, i quali non sono ancora 

stati chiariti. (1, 2) 

Secondo il dogma prevalente, la trasformazione clonale 

nelle MDS avverrebbe a livello di una cellula staminale 

commissionata in senso mieloide che può dare origine a 

globuli rossi, piastrine e granulociti. La caratteristica 

biologica di queste cellule staminali è una difettosa capacità 

di self-renewal e differenziazione (displasia), che si 

evidenzia attraverso la presenza di anomalie morfologiche 

di vario tipo. Alterazioni del cariotipo (che includono 

la perdita di materiale genetico e meno frequentemente 

traslocazioni bilanciate), vengono rilevate in circa il 

50% delle MDS primarie, e quando presenti, sono un 

indicatore di emopoiesi clonale. Tuttavia, anche se difetti 

citogenetici ricorrenti sono stati documentati nelle 

MDS già diversi anni fa, poche anomalie genetiche specifiche 

implicate nello sviluppo e/o nella progressione 

della malattia sono state descritte fino ad ora. (3) La 

valutazione morfologica della displasia emopoietica rappresenta 

la base della classificazione WHO di questi 

disturbi. (4) Questa classificazione offre ai clinici uno 

strumento molto utile per definire i diversi sottotipi di 

MDS e determinare la prognosi individuale. La combinazione 

della presenza di evidente displasia midollare e di 

anomalie citogenetiche clonali permette una diagnosi 

conclusiva di MDS. Tuttavia, questa combinazione si 

trova solo in alcuni pazienti, che tendono ad essere quelli 

con malattia più avanzata. In molti casi, infatti, la citogenetica 

non è informativa e la diagnosi di MDS si basa 


e-mail: matteo@haematologica.org 

interamente ed esclusivamente sulla valutazione morfologica. 

La proposta della WHO ha sollevato la questione della 

definizione dei criteri diagnostici minimi per le MDS. La 

morfologia può essere difficile da valutare, dato che le 

alterazioni cellulari delle cellule del midollo osseo non 

sono specifiche per le MDS e possono essere trovate in 

altre condizioni patologiche. Di conseguenza, nella pratica 

clinica la riproducibilità tra operatori per il riconoscimento 

della displasia è di solito scarsa, in particolare 

per i pazienti che non hanno marcatori morfologici specifici, 

come sideroblasti ad anello o eccesso di blasti. (5) 

Inoltre, la scarsa qualità dei preparati citologici è un ostacolo 

comune ad una diagnosi accurata di MDS. Infine, la 

morfologia può essere difficile da valutare in alcuni 

pazienti con midollo ipocellulare o fibortico. 

L’implementazione nella pratica clinica della classificazione 

WHO delle MDS implica un incremento dell’accuratezza 

nella rilevazione della displasia emopoietica a 

livello midollare. 

RAZIONALE PER L’APPLICAZIONE DELLA 

CITOMETRIA A FLUSSO NELLA DIAGNOSI 

DI MDS 

L’analisi immunofenotipica è stata introdotta nella classificazione 

WHO delle neoplasie ematologiche quale 

strumento indispensabile per la diagnosi, classificazione, 

stadiazione e monitoraggio di alcune patologie, come i 

disordini linfoproliferativi e le leucemie acute. (4) In 

aggiunta, l’immunofenotipo è stato proposto come strumento 

per migliorare la valutazione della displasia 

midollare. (6) Per essere clinicamente applicabile, 

l’analisi citofluorimetrica dovrebbe essere basata su 

parametri di adeguata specificità e sensibilità, i dati 

dovrebbero essere riproducibili tra differenti operatori e 

i risultati dovrebbero essere facilmente interpretabili 

dagli operatori clinici. (7) Rispetto a questa situazione 

ideale, i risultati degli studi che hanno esaminato 


29

l’applicabilità della citometria a flusso (FCM) nella diagnosi 

di MDS, hanno mostrato alcuni limiti. 

In primo luogo, non c’è un singolo parametro immunofenotipico 

in grado da solo di discriminare tra MDS e 

altre condizioni patologiche, e non c’è accordo su quali 

siano i parametri diagnostici più appropriati. Inoltre, la 

valutazione in FCM della displasia eritroide (che rappresenta 

il cardine della diagnosi morfologica di MDS) è 

particolarmente difficoltosa, a causa della limitata disponibilità 

di marcatori specifici. Infine, i protocolli pubblicati 

sono principalmente basati sull’analisi qualitativa di 

variabili citometriche, e sono testati su popolazioni 

molto eterogenee di pazienti, affiori che ne limitano 

l’applicazione clinica su vasta scala. (7, 8) 

A causa di queste limitazioni, al momento dell’introduzione 

della classificazione WHO (2001), l’analisi immunofenotipica 

non è stata raccomandata come procedura 

di screening per le MDS. Più recentemente, molti studi 

hanno affrontato i punti deboli della FCM nella diagnosi 

di MDS e sono stati fatti progressi significativi in questo 

contesto. 

Nel 2006 un gruppo di esperti internazionali si è incontrato 

a Bethesda per formulare raccomandazioni riguardo 

alla appropriatezza dei test citofluorimetrici in base al 

quadro clinico. (9) E’ stato raggiunto un consenso sul 

fatto che l’immunofenotipo sia indicato nella valutazione 

di pazienti con citopenia del sangue periferico: in questa 

situazione clinica, la FCM può stabilire la presenza di 

una patologia ematologica o, al contrario contribuire a 

dimostrare l’assenza di malattia. Inoltre, in accordo con i 

risultati della Working Conference del 2006 sulle MDS, 

l’immunofenotipo permette la rilevazione di anomalie 

nella differenziazione delle popolazioni cellulari midollari 

che non sarebbero altrimenti rilevabili tramite la 

morfologia.(10) Questi elementi sostengono l’utilità dell’immunofenotipo 

nel formulare una diagnosi definitiva 

di MDS, specialmente nei casi in cui non vi è significativa 

displasia morfologica o eccesso di blasti. Più recentemente, 

la revisione della classificazione WHO (2008) 

ha riconosciuto che l’analisi citofluorimetrica delle cellule 

emopoietiche può aggiungere importanti informazioni 

alla valutazione diagnostica e prognostica dei 

pazienti con MDS. (4) 

VALUTAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLA 

DISPLASIA MIELOIDE 

La displasia mieloide definita morfologicamente secondo 

i criteri WHO, è presente in circa il 60% dei pazienti 

di MDS alla diagnosi. Le più significative alterazioni 

morfologiche della linea granulocitaria includono ipogranularità 

delle cellule mieloidi, presenza di neutrofili 

pseudo-Pelger e aumento nel midollo osseo di cellule 

mieloidi negli stadi più precoci di maturazione. Queste 

anomalie influenzano significativamente la rilevazione 

dei parametri fisici (side scatter, SSC e forward scatter, 

FSC) in FCM. (11) 

La difettosa capacità di self-renewal e di differenziazione 

delle cellule staminali mielodisplastiche esita in 

diverse anomalie dell’ espressione antigenica delle cellule 

granulocitarie, che possono essere facilmente rilevate 

dalla FCM grazie ad una grande disponibilità di specifici 

anticorpi per linea mieloide. Aberrazioni della linea 

granulocitaria includono la presenza di antigeni che normalmente 

non sono espressi dalle cellule granulocitarie e 

l'espressione alterata di antigeni mieloidi. (8) (Figura. 1 

e Tabella 1). 

In dettaglio, nella serie granulocitaria dei pazienti affetti 

da MDS è presente un aumento percentuale di cellule 

granulocitarie con basso CD16 o di cellule con CD16 e 

CD11b entrambi bassi.(8, 12) Inoltre, un alterato modello 

di maturazione granulocitaria può essere dimostrato 

esaminando l’espressione di CD13 e CD16. Numerose 

anomalie dei pattern di maturazione CD13/CD16 sono 

state descritte in pazienti affetti da MDS, tra cui un 

aumento delle cellule negli stadi di mielociti e metamielociti 

e una diminuzione di neutrofili CD13+CD16+ 

(Figura. 1 e Tabella 1). (8, 12, 13) Lo studio di Stetler- 

Stevenson et al. pubblicato nel 2001 (8) è stato il primo 

a dimostrare che l'identificazione di anomalie immunofenotipiche 

tramite FCM è utile a stabilire una diagnosi di 

MDS, soprattutto quando i risultati della valutazione 

morfologica e gli studi citogenetici non sono conclusivi. 

Oltre alle anomalie di maturazione, nelle MDS sono stati 

descritte aberrazioni nell'espressione di diversi antigeni 

sui granulociti come CD64, CD10, e CD56. Antigeni linfoidi, 

come CD2, CD5, CD7 e CD19 possono essere 

espressi in modo anomalo dai progenitori mieloidi e 

dalle cellule mieloidi maturanti. (12-14) Inoltre, un risultato 

comune in questi pazienti è l'espressione atipica di 

antigeni su cellule mieloidi immature che sono normalmente 

espressi sulle cellule mieloidi mature, come 

CD11b e CD15. Per quanto riguarda il compartimento 

monocitico, le anomalie più frequenti osservate nei 

pazienti affetti da MDS sono l’alterata espressione di 

CD56, HLA-DR, CD36, CD33, CD15, CD14, CD13, e 

CD11b. (8, 12) In generale, il numero di anomalie 

segnalate dall’analisi citofluorimetrica è correlata con il 

grado di displasia morfologica. (8, 12) 

Le frequenze delle singole aberrazione mieloidi in 

pazienti affetti da MDS sono molto variabili in diversi 

studi. In generale una ridotta granulazione dei neutrofili 

si osserva nella grande maggioranza dei pazienti affetti 

da MDS (frequenza da 10 a 84% dei casi) e tale parametro 

è risultato essere altamente riproducibile se espresso 

come rapporto tra SSC dei granulociti e SSC dei linfociti. 

(11) Anomalie dei pattern maturativi granulocitari 

(CD11b/CD16 e CD13/CD16) sono stati segnalati con 

alta frequenza nelle MDS nonostante una grande variabilità 

in diversi studi (frequenza da 23 a 78%). Aberrazioni 

nell'espressione di CD64, CD10, CD56, e altri antigeni 

sui granulociti sono stati descritti in una percentuale 

compresa tra il 5% e il 66% dei casi di MDS. (8, 12, 14) 


Una singola anomalia mieloide evidenziata immunofenotipicamente 

è presente in circa il 30-40% dei pazienti 

affetti da citopenia non-clonale. (8, 12, 14) Pertanto, una 

singola anomalia mieloide evidenziata con FCM non è 

un dato sufficiente per una diagnosi definitiva dui MDS, 

e devono quindi essere rilevate altre anomalie sulle cel- 


Fig. 1. Caratteristiche immunofenotipica di displasia 

mieloide nelle MDS. (A-B) Anomalie mieloidi nelle 

MDS dimostrate in un plot CD45 vs SSC: (A) midollo 

osseo di un donatore sano: granulociti normali nella 

regione selezionata; (B) midollo osseo di un paziente 

con MDS e neutrofili ipogranulari con SSC basso. (C- 

E) Analisi del pattern maturativo granulocitario CD16 

vs. CD13: (C) midollo osseo di un donatore sano; (D-E) 

midollo osseo di un paziente con MDS con un incremento 

di cellule nelle fasi di maturazione mielocitaria e 

metamielocitaria e una diminuzione dei neutrofili segmentati 

CD13+CD16+. (F-H) Analisi del pattern maturativo 

granulocitario CD16 vs. CD11b: (F) midollo 

osseo di un donatore sano; (G-H) midollo osseo di un 

paziente rappresentativo con MDS che mostra una maggiore 

percentuale di granulociti con CD16 basso o con 

entrambi CD16 e CD11b bassi. 

Tabella 1. Frequenza e riproducibilità delle anomalie dei compartimenti granulocitario, eritroide e CD34+ nelle MDS 

lule granulocitarie per concludere che la displasia mieloide 

è presente. Attualmente la valutazione multiparametrica 

della maturazione mieloide e monocitaria e dei 

pattern di espressione antigenica consente l'identificazione 

di due o più anomalie immunofenotipiche 

nella grande maggioranza dei casi di MDS (dal 70% a 


31

32 

più del 90% in diversi studi) (8, 12, 14). Generalmente la 

citofluorimetria è più sensibile nel rilevamento della 

displasia mieloide rispetto alla morfologia e anomalie 

immunofenotipiche mieloidi vengono identificate anche 

in una percentuale significativa dei casi (da 20% a più 

del 90%) classificati come citopenia refrattaria con 

displasia unilineare (RCUD) o MDS non classificabile. 

(8, 12, 14) 

La grande variabilità della percentuale di anomalie 

immunofenotipiche in pazienti affetti da MDS riflette in 

parte l'eterogeneità biologica tra queste patologie, ma 

anche la mancanza di una procedura standardizzata 

riproducibile per la valutazione di questi parametri. 

L'approccio più largamente usato per valutare la displasia 

mieloide in FCM è l’analisi di riconoscimento di pattern 

maturativi. (8, 12, 13) Si tratta di un metodo qualitativo 

basato sul riconoscimento di una deviazione dal 

pattern normale di espressione dell’antigene. In modo 

simile alla valutazione morfologica, questo approccio è 

uno strumento molto efficace per operatori esperti, il 

riconoscimento di anomalie nei pattern maturativi presenta 

diversi punti deboli. La descrizione numerica dei 

risultati è difficile, così che l’analisi quantitativa non è 

possibile; inoltre la definizione precisa del pattern normale 

di riferimento può essere complessa; infine, con 

rare eccezioni, non sono attualmente disponibili dati di 

riproducibilità nel contesto di MDS (7, 8). Per superare 

queste limitazioni, alcuni studi hanno analizzato 

l'espressione di antigeni mieloidi come percentuale di 

cellule positive. (14) Si tratta di un metodo quantitativo 

che ha dimostrato di essere riproducibile, almeno tra 

diversi operatori di un laboratorio. Tuttavia, la definizione 

di una soglia tra le popolazioni positive e negative,che 

nella maggior parte dei metodi si basa in ultima analisi 

su criteri arbitrari, rimane un grande limite di questo 

approccio. Un metodo alternativo di analisi per esprimere 

le variabili citofluorimetriche in maniera quantitativa 

è l'intensità media di fluorescenza (MFI), definita come 

il rapporto tra l’MFI misurato del marcatore testato e 

l'autofluorescenza media misurata delle cellule. Analisi 

FCM di displasia del midollo tramite MFI appare particolarmente 

promettente. Infatti la MFI ha dimostrato di 

essere altamente riproducibile in contesti sia intralaboratorio 

che interlaboratorio.(14, 15) Inoltre, i rapporti di 

fluorescenza dipendono sia dalla percentuale di cellule 

che esprimono il marcatore testato che dall'intensità di 

espressione, che può essere importante nelle MDS, nelle 

quali le popolazioni del midollo sono tipicamente eterogenee 

per un particolare marcatore. 

VALUTAZIONE DELLA DISPLASIA ERITROIDE 

IN CITOMETRIA A FLUSSO 

La displasia eritroide è la pietra miliare della diagnosi 

morfologica delle MDS (4). La valutazione della displasia 

eritroide con FCM è particolarmente difficoltosa: la 

precisa identificazione dei precursori eritroidi midollari è 


problematica e c’è una limitata disponibilità di marcatori 

specifici. Il primo punto critico dell’analisi immunofenotipica 

del compartimento eritroide è la strategia di 

gating per identificare i precursori eritroidi nel midollo. 

Le cellule eritroidi nucleate sono caratterizzate da ridotto/assente 

CD45 e basso SSC. (16) Fare una regione 

sulle cellule con CD45 da debole a negativo e con basso 

SSC è certamente semplice e riproducibile. Tuttavia, in 

questa regione si trovano anche globuli rossi maturi 

(anucleati), detriti cellulari, e cellule non ematopoietiche 

che non sono discriminabili sulla base delle caratteristiche 

del CD45 o dello scatter. In alternativa, potrebbe 

essere eseguito un gate immunologico basato sugli antigeni 

espressi dalle cellule eritroidi. Durante lo sviluppo 

fisiologico da eritroblasti basofili a eritrociti, c'è una progressiva 

diminuzione dell’espressione di CD45. (16) Un 

aumento della glicoforina A (Gly-A) è osservato all'inizio 

della differenziazione da eritroblasto basofilo a eritroblasto 

ortocromico. Infine, il CD71 è uno dei primi 

antigeni a essere espresso durante la maturazione eritroide 

(che anticipa l’espressione di Gly-A), rimane sui reticolociti 

dopo enucleazione e poi viene perso prima della 

perdita dell’ RNA. (16) Da un punto di vista teorico, fare 

un gate sugli eritroblasti sulla base dell’espressione di 

CD71 sarebbe preferibile, dato che le cellule Gly A positive 

escludono una parte dei precursori eritroidi più 

immaturi, che possono essere aumentati nelle MDS. 

Tuttavia, è riportata una disregolazione dell'espressione 

di CD71 nelle MDS, (8) e quindi la Gly-A che ha un 

coefficiente di variazione di intensità molto stretto da 

individuo ad individuo, dovrebbe essere preferibilmente 

adottata nel gating dei precursori eritroidi nel contesto 

delle MDS. Anche il processo di lisi dei globuli rossi è 

critico: anche se un approccio no lyse-no wash fornisce 

una stima più accurata dei globuli rossi nucleati, un 

approccio lyse-no wash è certamente più semplice e più 

facilmente implementabile nella diagnosi di pazienti 

affetti da MDS. (7) 

Lo studio di Stetler-Stevenson et al. ha dimostrato per la 

prima volta la fattibilità della valutazione della displasia 

eritroide mediante FCM (8). Anomalie dei precursori eritroidi 

sono state individuate nella grande maggioranza 

dei casi studiati di MDS (77%). Tuttavia, la sola anomalia 

consistente della linea eritroide in questo studio è 

stata l’espressione asincrona di CD71 rispetto a Gly-A 

sugli eritroblasti. Un approccio promettente per superare 

la limitata disponibilità di marcatori specifici di displasia 

eritroide in FCM è l'analisi delle proteine metabolismo 

del ferro cellulare. (17) E' noto che il metabolismo del 

ferro è essenziale nelle cellule eritroidi per la produzione 

di eme ed è alterato in modo peculiare nelle MDS. A 

livello cellulare, la ferritina con le sue subunità H e L 

svolge un ruolo critico nella regolazione dell’omeostasi 

intracellulare del ferro, immagazzinando ferro all'interno 

del suo guscio multimerico. Essa svolge inoltre un ruolo 

importante nella detossificazione del ferro libero poten- 


zialmente dannoso in virtù dell'attività ferrossidasica 

della subunità H. Il recettore della transferrina CD71 è 

indispensabile per l'assorbimento del ferro dall’ambiente 

extra-cellulare. Le cellule eritroidi nelle MDS presentano 

un fenotipo “iron-loaded” caratterizzato da un aumento 

del contenuto della ferritina (in particolare subunità H) 

e riduzione del recettore della transferrina.(17) È interessante 

notare che l’espressione di ferritina H e del CD71 

riflettono il grado di displasia valutati dalla morfologia. 

Dati preliminari suggeriscono che un approccio multiparametrico 

basato sulla valutazione delle proteine del 

ferro permette di classificare correttamente oltre il 90% 

delle MDS e dei controlli patologici con una accettabile 

riproducibilità. (17) 

VALUTAZIONE DEI BLASTI E DEL 

COMPARTIMENTO CD34+ 

La trasformazione clonale nelle MDS avviene a livello di 

una cellula CD34+ commissionata in senso mieloide che 

ha un vantaggio competitivo rispetto al normale compartimento 

delle cellule staminali.(3) Questi precursori 

ematopoietici (blasti) sono morfologicamente definiti 

come cellule immature con cromatina lassa, nucleoli prominenti, 

basso rapporto nucleare/citoplasmatico, e nessuno 

o pochi granuli citoplasmatici. La valutazione del 

compartimento blastico ha rilevanza diagnostica nel 

sistema WHO, ed è stato riconosciuto che la percentuale 

di blasti midollari ha effetto prognostico nei pazienti con 

MDS. (4) 

Il primo tentativo di applicazione della FCM è stato di 

fornire una stima quantitativa dei blasti nel midollo 

osseo che avesse una maggiore sensibilità e riproducibilità 

rispetto alla conta morfologica. Purtroppo, la valutazione 

quantitativa in FCM dei blasti nel midollo delle 

MDS presenta limitazioni sia tecniche che intrinseche. 

In primo luogo, i blasti nelle MDS non sono le cellule 

predominanti nel midollo osseo, rendendo così difficile 

la loro analisi e, inoltre, i blasti mancano di marcatori 

immunofenotipici specifici.(6) La percentuale di cellule 

CD34+ determinate dalla FCM è stata testata come sostituta 

del conteggio visivo dei blasti. Tuttavia, anche se le 

cellule ematopoietiche che esprimono CD34 sono blasti, 

non tutti i blasti esprimono CD34.(14) Dovrebbe essere 

considerato inoltre che i campioni di midollo osseo per la 

valutazione morfologica possono variare notevolmente 

rispetto a quello per l’analisi in citofluorimetria. Quindi, 

l’analisi della percentuale di cellule CD34+ determinata 

in sostituzione del conteggio visivo nelle MDS è scoraggiata 

dalla corrente classificazione WHO. (4) 

Risultati più interessanti nell’ottica dell’applicazione 

della FCM nella diagnosi dei pazienti affetti da MDS 

derivano dall'analisi delle anomalie immunofenotipiche 

del compartimento delle cellule CD34+.(11, 18, 19) 

Come sottolineato in precedenza, il compartimento delle 

cellule CD34+ è alterato in modo peculiare nelle MDS e 

quindi i parametri CD34-correlati potrebbero essere 

buoni candidati per l'identificazione di marcatori diagnostici 

per questi disturbi. La trasformazione clonale nelle 

MDS avviene a livello di una cellula staminale mieloide: 

di conseguenza, la proporzione di cellule CD34+ è significativamente 

più alta nelle MDS rispetto ai soggetti 

sani, e la grande maggioranza delle cellule sono esprimono 

antigeni della linea mieloide.(11, 18, 19) Inoltre, nelle 

cellule CD34+ isolate da MDS a basso rischio è stata 

osservata una significativa down-regolazione dei geni 

legati al differenziamento B-cellulare rispetto ai controlli 

sani e ai pazienti con citopenia nonclonale, e oggi una 

riduzione di ematogoni allo stadio I è uno dei parametri 

immunofenotipici più consistenti in pazienti con MDS 

(19, 20). In diversi studi, è stata osservata una significativa 

diminuzione di progenitori B CD34+ nel 40-70% dei 

soggetti con una diagnosi conclusiva di MDS e nel 20- 

40% dei pazienti con citopenia nonclonale. (19, 20) 

L'analisi sia della percentuale di mieloblasti CD34+ che 

delle cellule B CD34+ ha dimostrato di avere una bassa 

variabilità inter-operatore. (19, 20). 

Diverse altre anomalie immunofenotipiche su cellule del 

compartimento CD34+ nelle MDS sono stati segnalate, 

tra cui l’asincrona co-espressione di antigeni di cellule 

staminali e di stadi mieloidi successivi (CD117, CD15 e 

CD11b) o l’anomala espressione di marcatori linfoidi 

(CD2, CD5, CD7,CD19 e CD56).(8, 11, 12, 14, 19) 

Tuttavia, la maggior parte di questi parametri non hanno 

adeguata riproducibilità nel contesto delle MDS (19, 21) 

con l'eccezione del rapporto tra CD45 su linfociti e CD45 

su mieloblasti che assicura accettabile variabilità interoperatore 

regolando i dati sulle cellule bersaglio con quelle 

dei linfociti nello stesso campione. Quando combinati 

insieme con la valutazione della SSC su granulociti, questi 

parametri differenziano correttamente la maggior parte 

delle MDS dai controlli patologici, con sensibilità che 

vanno dal 30 al 70% e specificità che vanno dall’80% a 

più del 90% in diversi studi. (11, 19) (Figura 2) 

È interessante notare che la valutazione dei parametri 

relativi al compartimento CD34+ sembra essere utile ai 

fini diagnostici anche in pazienti senza marcatori specifici 

di displasia midollare (sideroblasti ad anello e/o anomalie 

cromosomiche clonali).(19) Come sottolineato in 

precedenza, un problema critico per la valutazione morfologica 

della displasia midollare è che questa può essere 

ostacolata dalla presenza di ipocellularità, fibrosi, o 

inadeguata raccolta del campione. In questo contesto, la 

grande maggioranza di campioni di midollo,anche se 

diluito con del sangue periferico, fornisce dati accurati 

per la maggior parte dei parametri CD34-correlati (11). 

Tutti questi risultati suggeriscono che i parametri relativi 

al compartimento CD34+ sono buoni candidati per 

l'identificazione di marcatori diagnostici che non solo 

possono essere utilizzati per la diagnosi di pazienti affetti 

da MDS, ma sono anche relativamente stabili e riproducibili 

tra diversi operatori. 


34 

Fig. 2. Valutazione della displasia midollare mediante l'analisi di quattro parametri cardinale ottenuti dall’analisi di una singola aliquota 

di sangue midollare marcato con anticorpi anti-CD34 e CD45. Strategia di gating. (A) Tutte le cellule nucleate (P1) e cellule 

con SSC relativamente basso (R2). (B) Le cellule in R2 nel pannello A sono state visualizzate su un plot CD34-versus-CD45 ed è stato 

effettuato un gate sugli elementi CD34+CD45+ con espressione intermedia (P3). (C) Le cellule in R3 nel pannello B sono state visualizzate 

su un plot CD45-versus-SSC. I progenitori B cellulari CD34+ formano un cluster cellulare nella regione di cellule CD34+ in 

basso a sinistra (P5). Le cellule in P4 al contrario sono composte principalmente da mieloblasti. (D), Le cellule granulocitarie (P6) e 

i linfociti (P7) sono stati individuati su un plot CD45-versus-SSC. (E) SSC di linfociti (pannello superiore) e delle cellule granulocitiche 

(pannello inferiore). I valori del picco del canale SSC di entrambe le frazioni sono state calcolate utilizzando il software del citometro. 

(F) Espressione di CD45 sui linfociti (pannello superiore) e i mieloblasti CD34 + (pannello inferiore). L’intensità media di fluorescenza 

(MFI) di CD45 di entrambe le frazioni è stata calcolata. 

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Flow cytometric parameters with little interexaminer variability 

for diagnosing low-grade myelodysplastic syndromes. 

Leuk Res. 2008 May;32(5):699-707.

Viaggiando per convegni 

a cura del “Viaggiatore” 

Azienda Agrituristica Seliano 

A Paestum: insediamento fra i più suggestivi 

della Magna Grecia 

L’Azienda Agrituristica “Seliano” è in un area di circa 80 ettari, 

dove la campagna si arricchisce di testimonianze storiche e 

archeologiche, sorge, infatti, vicino all’area di Paestum, insediamento 

fra i più suggestivi della Magna Grecia e appartiene, fin 

dal periodo borbonico, ai Baroni Bellelli, a cui Edgar Degas intitola 

un suo celebre dipinto “La Famiglia Bellelli”, esposto a 

Museo D’Orsey di Parigi L’antico borgo, risalente a metà ‘800, 

è stato ristrutturato conservandone il suo aspetto originale infatti 

sia la club-house che la foresteria offrono un’atmosfera rustica 

ed accogliente, dove si trovano le 14 camere impreziosite da 

arredi d’epoca di raffinata semplicità. L’azienda comprende 

moderne scuderie con 10 cavalli, con i quali gli ospiti di Seliano 

possono far pratica nel maneggio, approfondire la tecnica 

equestre nel tondino con istruttori qualificati.Non a caso la famiglia 

Bellelli vanta una lunga tradizione in merito ai cavalli da 

corsa, in particolare il cavallo Salernitano che è stato medaglia 

d’oro a Vienna nel 1873 all’esposizione Universale. Per chi non 

va a cavallo è possibile rimanere distesi lungo i bordi della piscina 

della villa o recarsi al mare poco distante; inoltre è possibile 

scoprire angoli incontaminati del Parco del Cilento, seguendo 

percorsi poco frequentati dal turismo di massa e dove gli appassionati di funghi potranno inoltrarsi in boschi e radure alla loro ricerca. 

Particolare cura viene riservata alla cucina, seguendo la tradizione familiare dei proprietari, che ne curano personalmente la gestione. 

I cibi sono preparati con prodotti freschi, che provengono dalle aziende agricole di famiglia, ove vengono coltivati, secondo metodi naturali, 

i prodotti tipici della Piana del Sele, quali pomodori, zucchine, melanzane, peperoni, carciofi, da offrire ai propri Ospiti, e garantirne 

la migliore qualità. Gli Ospiti potranno seguire corsi di cucina tenuti personalmente dalla Padrona di casa, profonda conoscitrice della 

gastronomia del Cilento. Tra i prodotti tipici dell’Azienda c’è un raffinatissimo olio extravergine d’oliva ottenuto ancora con il tradizionale 

metodo di spremitura a pressione, aceto, limoncello, nocino, “rosoli d’altri tempi”, vengono venduti in bottiglie numerate e rappresentano 

solo alcuni dei prodotti che l’Azienda offre ai propri Ospiti; e ancora marmellate di arance, fichi e fragole, prodotti sott’olio come 

melanzane, olive, peperoni, pomodori, così come le paste fatte in casa e pane e pizze cotti con forno a legna. In azienda si allevano 

900 bufale di razza Mediterranea Italiana,dal cui latte si producono le ottime mozzarelle, ricotta ed altri formaggi tipici e vanto di “Seliano”, 

l’Azienda propone carne di vitello di bufala, una vera 

e propria leccornia. La prossima Conferenza a 

Salerno potrebbe offrire, agli Amici del GIC, 

l’occasione per un rilassante fine settimana a 

Paestum e godere della gastronomia e della squisita 

accoglienza dell’Azienda Agrituristica Seliano,: 

amichevolmente accolti da Ettore Bellelli e 

Collaboratori in cui spiccano le gentilissime ed efficienti 

Ragazze dello Staff di cucina, magistralmente 

guidate dalla Sig.ra Maria. 

Azienda Agrituristica Seliano 

Tenuta Seliano – 84047 Capaccio-Paestum 

Tel. 082.8723634 e 335.6674200 

e-mail: seliano@agriturismoseliano.it 

Lettere GIC Vol. 20, Num. 2 - Agosto 2011 VIAGGIANDO PER CONVEGNI 37

38 

MACSQuant ® VYB 

nuovo 

citometro 

a flusso 

Miltenyi Biotec, azienda leader nel settore della separazione immuno-magnetica 

(Tecnologia MACS®) e fornitore di più di 1000 prodotti, strumenti e service per la ricerca 

biomedica e per la clinica, ha recentemente annunciato il lancio di un nuovo citometro a flusso, 

il MACSQuant VYB. Il nuovo prodotto è stato ideato e costruito da Miltenyi Biotec con lo scopo 

di fornire ai ricercatori uno strumento altamente performante per analisi di proteine fluorescenti 

per cui risulta particolarmente adatto per tutti quei laboratori che lavorano nel campo della 

trasduzione del segnale e dello studio delle cellule staminali e del loro differenziamento. 

La presenza contemporanea di tre sorgenti LASER e l’elevato numero di parametri visualizzabili 

(dieci in totale: FSC, SSC e otto fluorescenze) consente a ricercatori che operano in campi 

diversificati di avere uno strumento flessibile per tutte le loro applicazioni. 

Il MACSQuant VYB è il secondo nato nella famiglia degli analizzatori 

citofluorimetrici offerti da Miltenyi Biotec e si va ad affiancare 

al MACSQuant Analyzer, lanciato poco più di 2 anni fa e già 

diffuso in numerosi laboratori facenti capo a istituti di fama internazionale. 

La principale novità del MACSQuant VYB sta nell’utilizzo 

in associazione ai LASER blu (488 nm) e violetto (405 nm) 

di un LASER giallo (561 nm) che, nel contesto di un banco ottico 

ottimizzato (vd Tabelle 1 e 2), consente l’analisi di numerose proteine 

fluorescenti (vd Figura 1). Questa prerogativa, unitamente 

alla maggior sensibilità per le ficoeritrine (PE) rende il 

MACSQuant VYB uno strumento unico nella sua categoria. Fatta 

eccezione per il banco ottico, le caratteristiche che hanno decretato 

il successo del MACSQuant Analyzer negli ultimi anni, sono riproposte 

senza variazioni nel MACSQuant VYB. Prima di tutto le 

dimensioni ridotte: il MACSQuant VYB è il citofluorimetro più 

compatto nella sua categoria. Il suo design (60×35×40 cm) lo rende 

perfetto per effettuare analisi multiparametriche sul bancone da 

laboratorio. Il computer e le bottiglie dei buffer sono integrate nel 

sistema, quindi lo strumento non necessita di alcun componente 

accessorio. In secondo luogo la conta cellulare assoluta volumetrica: 

il MACSQuant VYB sfrutta un sistema non pressurizzato di 

prelevamento del campione che consente, attraverso l’aspirazione 

tramite una pompa a siringa, di calcolare esattamente il volume del 

campione analizzato. Questa caratteristica permette di ottenere, al 

termine di ogni acquisizione, la conta assoluta (volumetrica) delle 

cellule contenute nel campione di partenza senza la necessità di utilizzare 

costose biglie per la conta. La calibrazione, cioè il processo 

che consente di verificare e, qualora necessario, modificare i 

parametri di voltaggio dei fotomoltiplicatori in modo da ottenere 

sempre la massima sensibilità dello strumento, viene effettuata 

mediante l’utilizzo di biglie fluorescenti ed è basata su un processo 

totalmente automatizzato. La compensazione si basa su una matrice 

8x8, e può essere eseguita con un processo automatizzato utilizzando 

sia cellule marcate con i singoli fluorocromi che biglie. La 

compensazione può essere effettuata sia durante l’acquisizione che 

successivamente. Il MACSQuant VYB può essere implementato 

con il MACS MiniSampler, un supporto robotizzato in grado di 

alloggiare diversi rack per consentire la massima flessibilità per 

quello che riguarda le provette da impiegare: 1,5 mL, 5 mL, 15 mL 

50 mL e piastre da 96 pozzetti. Il software del MACSQuant è in 

grado di controllare il prelevamento, la marcatura e il processamento 

dei diversi campioni in modo totalmente automatizzato. I singoli 

campioni possono comunque essere programmati individualmente 

variando qualunque parametro di acquisizione. Con la 

MACSQuant Cell Enrichment Unit, MACSQuant VYB è in 

grado di eseguire il pre-arricchimento di cellule marcate magneticamente 

prima dell’analisi citofluorimetrica (vd Figura 2). Questa 

caratteristica è basata sulla rinomata Tecnologia MACS che utilizza 

una colonna contenente una matrice di sfere di acciaio posta 

all’interno di un magnete permanente. L’unità di pre-arricchimento 

è utile principalmente per l’analisi di popolazioni cellulari rare, ad 

esempio sottopopolazioni di cellule staminali o cellule tumorali in 

circolo. Infine, il MACSQuant VYB non richiede nessun tipo di 

manutenzione ordinaria. Lo strumento lava l’ago di prelevamento 

del campione e la cella di flusso automaticamente tra un campione 

e l’altro e con un semplice click sullo schermo attiva i cicli di avvio 

e spegnimento senza nessun ulteriore intervento da parte dell’operatore. 

Questo tipo di automazione previene danni alla fluidica a 

consente il mantenimento nel tempo delle ottime performance della 

macchina. Con l’aggiunta del MACSQuant VYB, l’offerta di 

Miltenyi Biotec per la citometria a flusso si amplia ulteriormente e 

va di pari passo con l’espansione di una gamma di reagenti che riesce 

a coniugare perfettamente qualità e convenienza. 

Per maggiori informazioni: 

www.macsquant.com 

www.miltenyibiotec.com 

macs@miltenyibiotec.it

Figura 1: il MACSQuant VYB permette di rilevare un’ampia 

gamma di proteine fluorescenti. Cellule CHO trasfettate con CFP, 

GFP, YFP (riga superiore), mCherry ed mKate2 (riga inferiore) 

sono facilmente distinguibili da cellule non trasfettate (istogramma 

in viola). GFP e YFP sono spesso difficili da distinguere tra 

loro in citometria a flusso a causa delle somiglianze nei loro spettri 

di emissione. Con il MACSQuant VYB, cellule trasfettate 

conYFP (mostrate in giallo) e GFP (mostrate in verde) sono facilmente 

distinguibili quando visualizzate nel canale B2 (plot in 

basso a destra). Con il MACSQuant VYB è pertanto possibile 

analizzare fino a 5 proteine fluorescenti simultaneamente. 

Analisi sensibile di sottopopolazioni rare 

In genere, in citometria a flusso, il limite di frequenza per 

l’analisi di cellule rare è di circa un evento su 1000 

(0,1%), percentuale che corrisponde, ad esempio, alla 

frequenza di cellule staminali ematopoietiche nel sangue 

periferico. Altri tipi cellulari, come i progenitori endoteliali, 

i linfociti T antigene-specifici, o le cellule tumorali circolanti 

(CTC), possono presentarsi a frequenze notevolmente 

più basse (0,001% - 0,00001%). Un’analisi statisticamente 

significativa di queste cellule estremamente 

rare richiede l’acquisizione di un elevatissimo numero di 

eventi, in un processo lungo o addirittura impossibile a 

causa di limitazioni nelle dimensioni dei file. 

Tuttavia, un passaggio di arricchimento immunomagnetico 

preliminare facilita la valutazione di grandi numeri di 

cellule e aumenta di diversi logaritmi la frequenza delle 

cellule d’interesse. 

Il MACSQuant VYB, grazie alla MACS Enrichment Unit, 

permette l’integrazione in un unico strumento dei processi 

di arricchimento immunomagnetico ed analisi cellulare 

in citometria a flusso. Questo approccio rapido e 

riproducibile consente l’identificazione, la quantificazione 

e la caratterizzazione di cellule rare, e in tal modo 

può fornire una base tecnica per lo sviluppo di saggi 

standard diagnostici. 

Tabella 1: Configurazione del banco ottico del MACSQuant 

Analyzer, disponibile nelle versioni a 9 e 10 parametri. 

* Canale disponibile solo nella versione a 10 parametri. 

Figura 2: schema del procedimento per l’analisi di popolazioni 

rare mediante la MACSQuant Enrichment Unit, integrata nel 

MACSQuant VYB. 

Figura 3: analisi di linfociti T CD4+ stimolati con lisato di 

Aspergillus. Soltanto previo arricchimento immunomagnetico è 

possibile ottenere una frequenza di cellule T CD4+CD154+ tale 

da consentire l’analisi di sottopopolazioni di cellule secernenti 

(diagrammi a destra). 

Tabella 2: Configurazione del banco ottico del MACSQuant 

VYB. 

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Lo studio delle cellule tumorali circolanti: dalla sfida ... - Enea

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