Ingegneria genetica - dal genoma alle moderne tecniche di manipolazione

NEI CILIATI:

• Possiedono come detto, due nuclei diversi con funzione altrettanto diverse:

- Il micronucleo (o nucleo generativo) è diploide ma trascrizionalmente

inattivo in quanto implicato solo nel processo di riproduzione

- Il macronucleo (o nucleo vegetativo) è trascrizionalmente attivo in

quanto implicato in tutti i processi di sviluppo della cellula; è poliploide

in quanto costituito da migliaia di frammenti di DNA ciascuno dei quali

costituisce un gene (presente in numerose copie).

• Nonostante il mac derivi dal mic, di fatto la composizione del genoma

all’interno dei due nuclei è molto diversa (cromosomi lineari organizzati in loci

nel mic VS centinaia di migliaia di frammenti nel mac); questo è dovuto a

riarrangiamenti del DNA e a cicli di endoreplicazione dei cromosomi nei

macronuclei in via di sviluppo.

• Come abbiamo detto i frammenti di cromosoma presenti nel mac

corrispondono ciascuno a un gene, e ciò suggerisce un meccanismo di taglio

“preciso” durante la formazione del macronucleo: sembrerebbe infatti che tale

processo di frammentazione sia dovuto alla presenza di elementi trasponibili

ormai che inducono punti di taglio, determinando inoltre l’aggiunta di telomeri

→

in corrispondenza dei siti di clivaggio si formano dei veri e propri mini-

cromosomi.

• Ogni gene presente nel micronucleo e nel macronucleo non risulta essere

→

esattamente identico questo perché nel mic la sequenza degli esoni è

disordinata e durante lo sviluppo del mac questi vengono “riordinati” in modo

da originare la sequenza genica funzionale.

In Drosophila…

• Il mantenimento dei telomeri in assenza di telomerasi è dovuto al target

preferenziale di retro-trasposoni che, dopo aver copiato sé stessi, si integrano

a livello dell’estremità cromosomica.

Nell’uomo…

• La proteina centromerica CENP-B deriva da elementi trasponibili.

RICOMBINAZIONE V(D)J

• Si tratta di uno speciale processo di ricombinazione che avviene nei linfociti

immaturi durante la loro differenziazione negli organi linfoidi primari.

• Questo processo è responsabile dell’estrema variabilità dei recettori per

l’antigene dei linfociti B (Ig di membrana) e quindi degli anticorpi prodotti. Si

tratta di un tipo di ricombinazione somatica.

• La ricombinazione porta alla produzione di numerose combinazioni diverse dei

segmenti genici V, J e D nei locus per le Ig.

I riarrangiamenti avvengono secondo uno schema ben preciso nel locus per la

catena pesante: per prima cosa si ha l’avvicinamento di due segmenti genici in

modo da produrre un complesso D-J e in seguito si ha la formazione di una

regione continua contenente un segmento genico V,D e J. Il meccanismo però

non è un semplice processo “taglia e cuci”, bensì un complesso insieme di

reazioni che coinvolgono anche l’aggiunta o la delezione di nucleotidi in modo

da aumentare la variabilità delle immunoglobuline prodotte dal trascritto.

• Il sistema di taglio del meccanismo V(D)J deriverebbe dall’azione di enzimi simili

a trasposasi.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI:

• Operone Lac:

- Scoperto dagli studiosi Jacob e Monod in E.coli e pubblicato come “teoria

dell’operone”, varrà ai due il premio Nobel poco tempo dopo.

- E.coli metabolizza preferenzialmente e più facilmente il glucosio, ma in

sua assenza il batterio è in grado di metabolizzare anche altri zuccheri

utilizzando enzimi specifici per la sua degradazione.

Fino ad allora la teoria più accreditata era quella dell’ ”adattamento”,

secondo cui gli enzimi necessari al metabolismo di zuccheri diversi dal

glucosio si trovassero già in cellula sottoforma di precursori inattivi

(proenzimi) e resi operativi all’occorrenza (in presenza dell’induttore).

- Tale ipotesi si scontrava però con lo “shift diauxico” osservato durante la

crescita dei batteri in presenza di due diversi zuccheri, ad esempio

glucosio e lattosio: la cellula inizia a crescere velocemente consumando

prima il glucosio in quanto più facilmente metabolizzabile e una volta

esaurito passa all’altro zucchero presente. Questo si traduce in un

arresto temporaneo della crescita (fase lag) corrispondente al periodo

che le cellule impiegano per potersi adattare al metabolismo del nuovo

nutriente (sintesi degli enzimi necessari); questa fase di latenza è seguita

nuovamente da una fase di crescita esponenziale.

- Jacob e Monod quindi confutarono la teoria dell’ “adattamento” in

quanto riuscirono a dimostrare che gli enzimi deputati all’utilizzo di fonti

carboniose differenti dal glucosio, vengono prodotti secondo necessità,

quindi solo in assenza di glucosio.

Per poter dimostrare tale affermazione (ai tempi rivoluzionaria) decisori

di seguire le sorti di amminoacidi marcati radioattivamente e introdotti

in cellule in crescita prima dell’aggiunta di un induttore (un substrato in

grado di innescare l’incremento esponenziale nella produzione

dell’enzima necessario alla sua degradazione), in questo caso il lattosio.

→ una coltura di E.coli viene fatta crescere in presenza di solo glucosio

(assenza di lattosio) e amminoacidi radioattivi: tutte le proteine

risulteranno quindi marcate.

→ spostiamo la stessa coltura su terreno con lattosio e senza

amminoacidi marcati: secondo la precedente teoria dell’adattamento, la

β-galattosidasi (necessario alla degradazione del lattosio) sarebbe

dovuta già essere presente in cellula e quindi radioattiva; ciò che si

osservò fu invece un enzima (proteina) non marcato, a dimostrazione del

fatto che la sua sintesi era avvenuta al momento, quindi in relazione alla

presenza del lattosio anziché del glucosio. TRAMONTO DELLA TEORIA DEL

→

PRECURSORE concetto di induzione: sintesi proteica de novo

innescata dalla presenza di uno specifico substrato (induttore).

• Quando Jacob e Monod inducevano la produzione di β-galattosidasi, veniva

contemporaneamente prodotto l’enzima permeasi (necessario al trasporto del

lattosio attraverso la membrana del batterio) e anche l’enzima transacetilasi

(la cui funzione è ancora sconosciuta); Pertanto Jacob e Monod furono in grado

di identificare 3 geni controllati in modo coordinato (concetto di operone): il

gene LacZ codifica per la β-galattosidasi, il gene Y codifica per la permeasi, ed il

→

gene A codifica per la transacetilasi la mappatura ha definito Z, Y ed A come

geni strettamente associati sul cromosoma e trascritti in una molecola di

mRNA definita policistronica (recante l’informazione per la produzione di più

catene polipeptidiche coinvolte nel medesimo pathway).

• Ulteriori analisi genetiche hanno fatto luce sul circuito di controllo

dell’operone : Jacob e Monod isolarono e caratterizzarono una classe di

mutanti, definiti mutanti costitutivi, in cui i 3 enzimi venivano sintetizzati a

livelli massimi anche in assenza di un induttore. La mutazione è stata mappata

in un locus vicino ma distinto dai geni Z,Y ed A, definito come locus I, regione

di controllo dell’inducibilità degli enzimi lac.

→ +

cellule I sintetizzano livelli massimi di enzimi del sistema lac SOLO in

presenza di un induttore;

→ -

cellule I sintetizzano livelli massimi dei 3 enzimi in presenza o in assenza di

→

un induttore mutanti costitutivi.

• →

Venne identificato anche un substrato non induttore, il neolattosio su

terreno contenente solo neolattosio cresceranno solo i mutanti costitutivi, in

grado di metabolizzare tale substrato nonostante la mancanza di induzione.

Come si ottengono e selezionano i mutanti costitutivi?

• Si parte da una coltura di E.coli wt addizionata con glucosio, esposta a mutageni.

• Come avviene la selezione e l’isolamento dei mutanti?

- Passaggio della coltura da terreno con glucosio a terreno con lattosio e

viceversa per diverse volte;

- -

I mutanti costitutivi I inizieranno a crescere immediatamente (i 3 geni

dell’operone sono sintetizzati a livelli massimi anche in assenza di

induttore e quindi questi individui potranno impiegare rapidamente gli

enzimi per il metabolismo del lattosio)

- I wt invece necessitano di almeno 40 minuti per poter crescere in lattosio

dopo lo shift, in quanto necessitano di adattarsi al nuovo nutriente

attivando l’operone e quindi la sintesi degli enzimi necessari.

- Dopo 15-20 passaggi nell’ultima coltura si ottengono praticamente solo

mutanti costitutivi (non viene permesso l’adattamento dei wt).

La scoperta dei fattori F’ recanti l’operone lac ha permesso la costruzione di diploidi

+

parziali con la possibilità di effettuare test di complementazione. Prove con alleli I e

- + -

I hanno dimostrato che I è dominante in trans su I , in quanto il prodotto di I agisce

→ -

attraverso il citoplasma come repressore (trans-agente) quindi le mutazioni I sono

+

recessive rispetto al tipo selvatico I che sintetizza una molecola di repressore che è

in grado di legarsi ad entrambi gli operatori in una cellula diploide e bloccare

l’espressione dell’operone lac (in assenza di un induttore). La presenza dell’induttore

blocca il repressore, legandolo e non permettendogli di legarsi all’operatore.

• →

I primi due ceppi sono “di controllo”

ceppo 1 wt:

- induco, viene prodotta beta-galattosidasi

- non induco, non viene prodotta

ceppo 2 mutante costitutivo:

- induco, viene prodotta beta-galattosidasi

- non induco, viene prodotta beta-galattosidasi

• Il terzo ceppo è un diploide parziale generato dalla trasmissione di un fattore F’

- +

recante l’allele recessivo I , all’interno di una cellula I e mutante per il gene lacZ.

- Induco, viene prodotta b.galattosidasi nonostante la mutazione nel gene

in quanto una copia sana di lacZ è portata da F’.

- Non induco, non avrò produzione di b.galattosidasi in quanto nonostante

+

la recessività di I portato da F’, il repressore codificato da I in cellula è

sufficiente per bloccare l’espressione di entrambe le copie dell’operone.

→ stesso comportamento di un wt.

• Il quarto ceppo è un diploide parziale generato dalla trasmissione di un fattore

+

F’ recante l’allele dominante I (codificante per il repressore) ma con una

mutazione nel gene lacY (difettivo per la produzione di permeasi), in una cellula

- -

I Z - Induco, viene prodotta b.galattosidasi in quanto la copia integra di lacZ

si trova su F’.